[發明專利]基于微流控芯片檢測呼吸道合胞病毒A、B型的試劑盒及其使用方法

有效

• 申請號: 201810457543.4
• 申請日: 2018-05-14
• 公開（公告）號: CN108411039B
• 公開（公告）日: 2021-06-11
• 發明（設計）人: 許行尚;杰弗瑞·陳;王龍;于沛;張蓉蓉
• 申請（專利權）人: 南京嵐煜生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686
• 代理公司: 南京正聯知識產權代理有限公司 32243
• 代理人: 王素琴

本發明公開了一種基于微流控芯片的檢測呼吸道合胞病毒A、B型的試劑盒以及使用方法，該試劑盒包括有主動控制流路的多通量微流控核酸檢測芯片、預裝干粉檢測試劑和陽性質控品；所述預裝干粉檢測試劑含有呼吸道合胞病毒A、B型的特異性保守序列的引物及TaqMan熒光探針。本發明的試劑盒采用的是微流控芯片技術，加樣后所有操作都由儀器完成，操作簡便，速度快，可在30～60min內完成檢測，且不會造成污染；采用TaqMan探針熒光PCR技術，針對呼吸道合胞病毒A、B型進行檢測，設計引物和探針的序列在呼吸道合胞病毒A、B型的基因中都非常保守，特異性強，并能夠在2小時內獲得檢測結果，靈敏度可達10copies/μL。

技術領域

本發明涉及分子生物學領域，具體涉及一種基于微流控芯片的檢測呼吸道合胞病毒A、B型的試劑盒及其使用方法。

背景技術

呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus，RSV)是一種單鏈RNA病毒，屬于副粘液病毒科，是造成世界范圍內嬰幼兒下呼吸道病毒性感染最常見的原因之一。由于RSV在細胞中可以引起細胞融合病變，根據它在細胞培養中的細胞病變特征命名為呼吸道合胞病毒。

RSV最顯著的特征是每一次RSV感染只能調節以后感染的嚴重程度，產生的抗體并不能對機體產生永久性保護，因此RSV可反復感染。母傳抗體也不能預防感染的發生，因而出生不久的小嬰兒即可發病，常引起小兒間質性肺炎及毛細支氣管炎，是引起小兒病毒性肺炎最常見的病原體。嬰幼兒癥狀較重，可有高熱、鼻炎、咽炎及喉炎，以后表現為毛細支氣管炎及肺炎。少數病兒可并發中耳炎、胸膜炎及心肌炎等。成人和年長兒童感染后，主要表現為呼吸道感染。潛伏期3～7天，RSV感染有明顯的季節性，主要暴發流行于冬春季節，每年的11月～次年2月為暴發流行的高峰季節。

呼吸道合胞病毒是由包裹負鏈RNA的核衣殼和包膜組成的，其基因組編碼10種蛋白質，包括7種結構蛋白(G、F、M1、M2、P、L、N)和3種非結構蛋白(NS1、NS2、SH)，其中G蛋白和F蛋白位于病毒顆粒的表面，是主要的糖蛋白。RSV根據抗原性的不同可分為A、B兩亞型，兩亞型間的主要區別在于G蛋白的基因差異，G蛋白是RSV毒株中變異最大的蛋白，僅存在5％的抗原相關性。有文獻報道，A亞型呼吸道合胞病毒相較于B亞型，具有更強的致病性，嬰幼兒感染后，B亞型比A亞型對同型G蛋白的抗原反應更強烈且有效。

我國每隔數年會出現由呼吸道合胞病毒感染導致的流行性喘憋型肺炎，常造成數十萬人發病，不同年份A、B亞型可以交替成為流行優勢株。RSVA、RSVB亞型患兒均以咳嗽、喘息為主要癥狀，其次為鼻塞流涕、發熱、呼吸困難，兩亞型臨床表現無明顯差異。利用分子技術可以快速、準確地進行分型，避免誤用或者濫用堿性藥物，對呼吸道感染早期診斷以及正確治療的意義十分重大。

目前市場上針對呼吸道合胞病毒的檢測方法主要有病毒培養法、免疫檢測法和熒光PCR法。培養法是把病原體在特定培養基上進行培養，再對產生的結果進行觀察分析。免疫法是通過抗原抗體發生特異性結合來檢測目的蛋白。熒光PCR法是在PCR擴增過程中，通過熒光信號，對PCR進程進行實時監測，定性或定量檢測目的基因。

微流控芯片(microfluidics)或稱芯片實驗室(Lab-on-a-Chip)是指把生物和化學等領域中所涉及的樣品制備，生物與化學反應，分離、檢測等基本操作單元或基本集成到一塊幾平方厘米(甚至更小)的芯片上，用以完成不同的生物或化學反應過程，并對其產物進行分析的一種技術。這種技術原則上適用于從核酸、蛋白質直到有機、無機小分子的各種不同類型分子的反應、分離和檢測。微流控芯片具有液體流動可控、消耗試樣和試劑極少、分析速度成十倍上百倍地提高等特點,它可以在幾分鐘甚至更短的時間內進行上百個樣品的同時分析,并且可以在線實現樣品的預處理及分析全過程。