[發(fā)明專(zhuān)利]用于歐鰉苗種鑒定的生物傳感檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810456781.3
• 申請(qǐng)日: 2018-05-14
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108913778B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-07-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙紫霞;江炎亮;許建;張研
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/6888
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/6888;C12Q1/686;C12Q1/6825
• 代理公司: 北京遠(yuǎn)大卓悅知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11369
• 代理人: 史霞

1.一種用于歐鰉苗種鑒定的生物傳感檢測(cè)方法，以待測(cè)苗種的DNA為模板進(jìn)行探針延伸獲得探針延伸產(chǎn)物，應(yīng)用生物傳感檢測(cè)方法檢測(cè)所述探針延伸產(chǎn)物是否能夠通過(guò)錨定標(biāo)記分子錨定至修飾有錨定受體的電極表面并產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào)，若是，則待測(cè)苗種為歐鰉苗種，其中，包括以下步驟：

在探針延伸中，將帶有錨定標(biāo)記分子的dUTP連接至如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列的探針上以獲得所述待測(cè)苗種中歐鰉苗種的探針延伸產(chǎn)物；

在探針延伸之前，向提取的待測(cè)苗種的DNA中依次加入dATP、dTTP、帶有錨定標(biāo)記分子的dUTP、DNA聚合酶、緩沖液和如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列作為歐鰉特異性單鏈DNA探針構(gòu)建探針延伸反應(yīng)體系。

2.如權(quán)利要求1所述的用于歐鰉苗種鑒定的生物傳感檢測(cè)方法，其特征在于，

提取待測(cè)苗種的DNA，以如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列作為特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，純化PCR產(chǎn)物；

向所述純化PCR產(chǎn)物中加入dATP、dTTP、帶有錨定標(biāo)記分子的dUTP、DNA聚合酶、緩沖液和如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列作為歐鰉特異性單鏈DNA探針構(gòu)建探針延伸反應(yīng)體系并進(jìn)行探針延伸。

3.如權(quán)利要求2所述的用于歐鰉苗種鑒定的生物傳感檢測(cè)方法，其特征在于，向所述純化PCR產(chǎn)物中加入dATP、dTTP、帶有錨定標(biāo)記分子的dUTP、DNA聚合酶及其緩沖液，之后分為均等的兩份；其中一份中加入如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列作為歐鰉特異性單鏈DNA探針以構(gòu)建探針延伸反應(yīng)體系并進(jìn)行探針延伸獲得探針延伸產(chǎn)物Ⅰ；另一份中加入如SEQ IDNO:4所示的核苷酸序列作為鱘屬通用性單鏈DNA探針以構(gòu)建探針延伸反應(yīng)體系并進(jìn)行探針延伸獲得探針延伸產(chǎn)物Ⅱ；

將所述探針延伸產(chǎn)物Ⅰ和所述探針延伸產(chǎn)物Ⅱ分別滴加于兩支修飾有錨定受體的電極表面進(jìn)行錨定反應(yīng)，檢測(cè)所述電極表面是否存在所述電化學(xué)活性標(biāo)記分子的電化學(xué)信號(hào)，若兩支修飾有錨定受體的電極表面均能夠檢測(cè)到所述電化學(xué)標(biāo)記分子的電化學(xué)信號(hào)，表明所述待測(cè)苗種為具有歐鰉血統(tǒng)的雜交鱘；若滴加所述探針延伸產(chǎn)物Ⅰ的電極表面未檢測(cè)到所述電化學(xué)標(biāo)記分子的電化學(xué)信號(hào)，滴加所述探針延伸產(chǎn)物Ⅱ的電極表面檢測(cè)到所述電化學(xué)標(biāo)記分子的電化學(xué)信號(hào)，表明所述待測(cè)苗種為除歐鰉之外的其他鱘魚(yú)；

若兩支修飾有錨定受體的電極表面均未檢測(cè)到所述電化學(xué)標(biāo)記分子的電化學(xué)信號(hào)，則探針延伸反應(yīng)體系異常，檢測(cè)失敗。

4.如權(quán)利要求1所述的用于歐鰉苗種鑒定的生物傳感檢測(cè)方法，其特征在于，所述的電化學(xué)活性標(biāo)記分子為能夠發(fā)生可逆或準(zhǔn)可逆氧化還原反應(yīng)的分子，為二茂鐵及其衍生物、鐵氰化鉀、硫堇、鄰苯二酚、對(duì)苯二酚、稀土單酞菁、銥氯水配合物、血紅蛋白和肌紅蛋白中的任意一種。

5.如權(quán)利要求1所述的用于歐鰉苗種鑒定的生物傳感檢測(cè)方法，其特征在于，所述的電化學(xué)信號(hào)為差分脈沖伏安信號(hào)、循環(huán)伏安信號(hào)或交流阻抗信號(hào)。

6.如權(quán)利要求2所述的用于歐鰉苗種鑒定的生物傳感檢測(cè)方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min，然后94℃變性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s，從預(yù)熱、退火到延伸重復(fù)25個(gè)循環(huán)，然后72℃延伸5min，94℃變性5min，迅速降溫至4℃。

7.如權(quán)利要求1所述的用于歐鰉苗種鑒定的生物傳感檢測(cè)方法，其特征在于，dATP、dTTP、dUTP物質(zhì)的量比為2:1:1；

其中，所述的DNA聚合酶為Bst DNA聚合酶時(shí)，探針延伸的反應(yīng)溫度為60-65℃，反應(yīng)時(shí)間為1-3min；

所述DNA聚合酶為高保真Taq DNA聚合酶時(shí)，探針延伸反應(yīng)溫度60-70℃，反應(yīng)時(shí)間為1-3min。