[發明專利]一種從人體血液中性粒細胞的嗜天青顆粒中分離純化天然蛋白酶3的方法

有效

• 申請號: 201810454057.7
• 申請日: 2018-05-14
• 公開（公告）號: CN108611343B
• 公開（公告）日: 2021-04-13
• 發明（設計）人: 孫鵬;康雅明
• 申請（專利權）人: 武漢博百歐生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/64
• 分類號: C12N9/64
• 代理公司: 武漢藍寶石專利代理事務所(特殊普通合伙) 42242
• 代理人: 廉海濤

本發明提供了一種從人體血液中性粒細胞的嗜天青顆粒中分離純化天然蛋白酶3的方法，步驟包括：使用從人體輸血后廢棄醫療用品中回收并提取的中性粒細胞嗜天青顆粒,經研磨，溶解，離心后獲得含有蛋白酶3的層析過柱起始蛋白溶液，結合陽離子交換層析柱，染色配體層析柱，分子篩層析柱以及親和層析柱等純化方法從人體血液中性粒細胞嗜天青顆粒中分離、純化天然蛋白酶3。采用上述方法制備得到的天然蛋白酶3在產量、純度、活性、特異性以及穩定性上均有大幅度的提高，其高質量更適用于科學研究以及醫學檢測。

技術領域

本發明涉及醫學檢測產品技術領域，具體涉及一種從人體血液中性粒細胞的嗜天青顆粒中分離純化天然蛋白酶3的方法。

背景技術

抗中性粒細胞胞漿抗體(ANCA)是在壞死性小血管炎中發現的。這些抗體大部分屬于IgG類型，在乙醇固定的中性粒細胞和單核細胞的間接免疫熒光反應中有很明顯的陽性反應，它們其中一個主要靶點是蛋白酶3(PR3)抗原(即是所謂的胞漿型cANCA)。抗蛋白酶3(PR3)特異性抗體是中性粒細胞特異性自身抗體相關脈管炎疾病，特別是韋格納肉芽腫病(Wegener’s granulomatosis)的一種敏感的和特異性的標記物，可輔助臨床醫生診斷各種系統性炎癥疾病。該抗體在活動性韋格納肉芽腫病(GPA)以及全身性血管炎患者中的特異性大于90％。抗蛋白酶3(PR3)抗體陽性也可見于少數多動脈炎(MPA)，Chung-Strauss綜合征(CSS)，結節性多動脈炎(PAN)少數巨細胞動脈炎，過敏性紫癜，白細胞破碎性皮膚血管炎和白塞氏病等。目前中性粒白細胞間接免疫熒光檢測(IIF)和標準化的抗蛋白酶3(PR3)抗體ELISA檢測相結合的檢測方法被廣泛適用于以上疾病的檢測。抗蛋白酶3(PR3)抗體在臨床上另一重要應用價值在于該抗體效價與病情活動一致，在GPA等原發性血管炎患者常被作為判斷療效、估計復發的指標，從而指導臨床治療。對抗蛋白酶3(PR3)抗體進行高靈敏度，高準確性的檢測，需要診斷試劑中的核心原料蛋白酶3(PR3)抗原具備高純度，高活性，高特異性等特質，來避免檢測結果中可能出現的假陽性，假陰性。這對蛋白酶3(PR3)抗原的制備提出了很高的要求。

目前市場中，用于檢測產品開發的抗原原料主要分為重組表達和天然提取兩個來源。相對于利用宿主細胞表達出的重組抗原，從人體血液細胞中提取并純化的天然抗原具備諸多優勢，包括：高度的氨基酸序列同源性，天然的蛋白質三級以及四級構象，正確的人血細胞翻譯后修飾過程(如磷酸化，糖基化等)，以及完整的蛋白功能表達所需的抗原受體和抗原表位等。同時，天然抗原不存在重組抗原通常都有的聚集和溶解度的問題，可以更加良好充分的和其特異性抗體相結合，從而降低檢測的差異性。然而由于天然蛋白的資源有限,來源各異,導致大規模，批量提取天然抗原具有一定難度,且成本昂貴。

過去的文獻中介紹天然蛋白酶3(PR3)純化的方法主要是常規的色譜層析法，通常以嗜中性粒細胞的全細胞裂解液作為初始粗蛋白液。但是全細胞裂解液含有大量的細胞雜蛋白，需要復雜的后續色譜層析分離、純化步驟。

成功純化蛋白酶3的較早報道出現在上世紀80年代。1988年，J Clin Invest.82(6):1963-73，Proteinase 3.A distinct human polymorphonuclear leukocyteproteinase that produces emphysema in hamsters，by Kao RC,Wehner NG et.al.簡單粗略的介紹了蛋白酶3的純化方法.

1992年，ANCA-Associated Vasculitides:Immunological and ClinicalAspects，1(1)：56-58,Proteinase 3:Substrate Specificity and PossiblePathogenetic effect of Wegener’s Granulomatosis Autoantibodies(c-ANCA)byDysregulation of the enzyme，by Wolfgang L.Gross沿用了過去使用染料配體親和層析法，初步分離白細胞顆粒并提取純化蛋白酶3的方法。此方法產生蛋白純度較低。