[發明專利]一種從人體血液中性粒細胞的嗜天青顆粒中分離純化天然蛋白酶3的方法

有效

• 申請號: 201810454057.7
• 申請日: 2018-05-14
• 公開（公告）號: CN108611343B
• 公開（公告）日: 2021-04-13
• 發明（設計）人: 孫鵬;康雅明
• 申請（專利權）人: 武漢博百歐生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/64
• 分類號: C12N9/64
• 代理公司: 武漢藍寶石專利代理事務所(特殊普通合伙) 42242
• 代理人: 廉海濤

1.一種從人體血液中性粒細胞的嗜天青顆粒中分離純化天然蛋白酶3的方法，其特征在于：步驟包括：S1、研磨、溶解：將嗜天青顆粒細胞組織研磨均勻，高速離心去除不溶解雜質獲得過柱起始蛋白溶液；S2、陽離子交換層析：將起始蛋白溶液負載于陽離子交換柱層析柱中，使用梯度鹽度層析洗脫方式進行洗脫，得到初級純化蛋白樣品；S3、染色配體層析：將初級純化蛋白樣品再通過染色配體層析柱進一步洗脫去除雜質，得到二級純化蛋白溶液；S4、分子篩層析：將二級純化蛋白溶液通過分子篩層析柱進一步洗脫分離蛋白酶3抗原，分餾收集洗脫液得到三級純化蛋白溶液；S5、親和層析：經過親和層析柱將三級純化蛋白溶液中的雜蛋白進一步洗脫剔除，得到最終成品；

步驟S2中，所述陽離子交換柱層析柱中采用的層析緩沖液為20-50mM醋酸鈉,pH5.4-5.6,0.02-0.05％Lubrol；依次采用洗脫緩沖液1和洗脫緩沖液2進行梯度鹽度層析洗脫，所述洗脫緩沖液1為20-50mM醋酸鈉,pH5.4-5.6,0.02-0.05％Lubrol,0-0.3M NaCl，所述洗脫緩沖液2為20-50mM醋酸鈉,pH5.4-5.6,0.02-0.05％Lubrol,0.4-0.6M NaCl；

步驟S3中，所述染色配體層析柱中采用的層析緩沖液為20-50mM醋酸鈉,pH5.4-5.6,0.02-0.05％Lubrol，所述洗脫采用的洗脫緩沖液為20-50mM醋酸鈉,pH5.4-5.6,0-2MNaCl,0.02-0.05％Lubrol；

步驟S4中，所述洗脫采用的洗脫緩沖液為15-25mM Hepes-NaOH,pH 7.5-8.5，0.02-0.05％Lubrol,0.1-0.5M NaCl；

步驟S5中，所述洗脫采用的洗脫緩沖液為15-25mM Hepes-NaOH,pH 7.5-8.5，0.02-0.05％Lubrol,0.1-0.5M NaCl。

2.如權利要求1所述的從人體血液中性粒細胞的嗜天青顆粒中分離純化天然蛋白酶3的方法，其特征在于：步驟S1中，所述嗜天青顆粒細胞組織采用以下方法得到：采用PBS緩沖液洗脫原材料中的白細胞，洗脫液離心，棄上清保留下層細胞層，向細胞層中加入細胞裂解液后離心，取下層沉淀，即得嗜天青顆粒細胞組織。

3.如權利要求1所述的從人體血液中性粒細胞的嗜天青顆粒中分離純化天然蛋白酶3的方法，其特征在于：步驟S1中，采用電動玻璃均漿器研磨并溶解嗜天青顆粒細胞組織；所述高速離心為轉速14000～16000rpm下離心25～35分鐘。