[發(fā)明專利]一種提高紫花苜蓿游離小孢子出胚率的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810450810.5
• 申請日: 2018-05-11
• 公開（公告）號: CN108633736B
• 公開（公告）日: 2022-01-21
• 發(fā)明（設計）人: 儀登霞;王贊;蘇彥賓
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 北京華仲龍騰專利代理事務所(普通合伙) 11548
• 代理人: 黃玉玨

本發(fā)明公開的一種提高紫花苜蓿游離小孢子出胚率的方法，包括在紫花苜蓿盛花期，從供體植株上挑選健壯無病蟲害花蕾，選取游離小孢子處于單核居中期的花蕾進行培養(yǎng)。本發(fā)明的優(yōu)點在于，能夠快速、高效獲得紫花苜蓿的小孢子胚，出胚率達到44.22個/蕾，進而獲得的再生植株可用于紫花苜蓿單倍體育種。

技術領域

本發(fā)明屬于生物科學技術領域，具體為一種提高紫花苜蓿游離小孢子出胚率的方法。

背景技術

單倍體育種具有巨大的商業(yè)應用價值，利用單倍體誘導產(chǎn)生單倍體植株，進而自然或人工加倍，即可在兩年內(nèi)獲得純合的育種材料，可以顯著加快選擇進程，縮短育種周期。紫花苜蓿(Medicago sativa L.)屬多年生異花授粉植物，其群體的遺傳組成復雜多樣，基因型長期處于雜合狀態(tài)，植株自交不親和，因此紫花苜蓿主要采用混合選擇、綜合品種育種、輪回選擇等方法選育新品種。但是利用上述方法至少需要6-7年的時間才能選育出一個優(yōu)良的群體，且極難得到純合的材料，育種周期長、難度大、效率低，單倍體育種則是紫花苜蓿育種途徑的理想選擇之一，只需要經(jīng)過兩個世代就可以選育出基因型完全純合的材料，簡化了育種流程，提高了育種效率。

目前植物游離小孢子培養(yǎng)技術已成為獲得單倍體植株的最重要手段之一。現(xiàn)已在250多個物種上進行了小孢子培養(yǎng)技術的研究，紫花苜蓿采用游離小孢子培養(yǎng)后出胚率較低，且未有獲得單倍體植株的報道。因此，急需通過優(yōu)化一些影響植物小孢子出胚率的因素，提高紫花苜蓿小孢子的出胚率，并進而獲得單倍體植株，對加快小孢子培養(yǎng)技術在紫花苜蓿育種中的應用具有重要的理論意義和實用價值。

發(fā)明內(nèi)容

為解決現(xiàn)有技術中紫花苜蓿采用游離小孢子培養(yǎng)后出胚率較低的技術問題，本發(fā)明提供了一種提高紫花苜蓿游離小孢子出胚率的方法，實現(xiàn)的目的為能夠快速、高效獲得紫花苜蓿的小孢子胚，出胚率達到44.22個/蕾，進而獲得的再生植株可用于紫花苜蓿單倍體育種。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術方案為，本發(fā)明提供了一種提高紫花苜蓿游離小孢子出胚率的方法，該方法包括在紫花苜蓿盛花期，從供體植株上挑選健壯無病蟲害花蕾，選取游離小孢子處于單核居中期的花蕾進行培養(yǎng)。本發(fā)明選擇游離小孢子處于單核居中期的花蕾進行培養(yǎng)，是由于單核居中期的游離小孢子出胚率最高，顯著高于小孢子其他的時期出胚率。

進一步的，在對所述花蕾進行培養(yǎng)前，對所述花蕾先用75％酒精消毒30s，之后用8％次氯酸鈉消毒12min，無菌水沖洗5次后放于無菌研缽中，采用無菌操作能夠有效防止小孢子被污染。

進一步的，所述培養(yǎng)方法包括在無菌研缽中加入半量MS液體培養(yǎng)基與B5液體培養(yǎng)基，MS液體培養(yǎng)基與B5液體培養(yǎng)基的體積比為1:1，用研棒輕輕擠壓使小孢子游離于所述混合培養(yǎng)基溶液中，用400目孔徑尼龍網(wǎng)紗過濾收集濾液，離心3次，每次3min，然后將濾液懸浮于半量MS液體培養(yǎng)基與半量NLN液體培養(yǎng)基所組成的混合培養(yǎng)基中，MS液體培養(yǎng)基與NLN液體培養(yǎng)基的體積比為1:1，調(diào)整小孢子在MS液體培養(yǎng)與NLN液體培養(yǎng)基所組成的混合培養(yǎng)基中密度至1×10⁴個/mL。

進一步的，所述小孢子在MS液體培養(yǎng)與NLN液體培養(yǎng)基所組成的混合培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，將接種有小孢子的MS液體培養(yǎng)與NLN液體培養(yǎng)基所組成的混合培養(yǎng)基分裝于無菌、直徑為60mm的培養(yǎng)皿中，每皿2mL。將小孢子分裝培養(yǎng)可提供更為舒適的空間。

進一步的，所述培養(yǎng)方法包括向MS液體培養(yǎng)與NLN液體培養(yǎng)基所組成的混合培養(yǎng)基中添加100μL質(zhì)量濃度為2％的活性炭，封口，4℃低溫暗培養(yǎng)24h后，轉(zhuǎn)到35℃高溫暗培養(yǎng)72h，再轉(zhuǎn)到25℃暗培養(yǎng)直至出胚。選擇的具體溫度條件有利于提高小孢子出胚率。所添加的活性炭可為小孢子的發(fā)育提供暗環(huán)境；吸附離體培養(yǎng)中的抑制性物質(zhì)；對離體培養(yǎng)有益物質(zhì)解吸附。

進一步的，在游離小孢子出胚3周后，將胚轉(zhuǎn)至B5固體培養(yǎng)基中，在25℃、光照16h/d條件下培養(yǎng)成再生植株。通過本發(fā)明方法提高游離小孢子出胚率，還可以利用繼續(xù)培養(yǎng)的再生植株可用于紫花苜蓿單倍體育種。