[發明專利]一種獲得嗜熱屬真菌陽性轉化子的方法

有效

• 申請號: 201810449674.8
• 申請日: 2018-05-11
• 公開（公告）號: CN108611283B
• 公開（公告）日: 2022-03-15
• 發明（設計）人: 牛雪梅;何佳寧;張克勤
• 申請（專利權）人: 云南大學
• 主分類號: C12N1/15
• 分類號: C12N1/15;C12N15/90;C12R1/645
• 代理公司: 北京聿華聯合知識產權代理有限公司 11611
• 代理人: 劉烽

本申請提供了一種獲得嗜熱屬(Thermomyces)真菌陽性轉化子的方法，其包括如下步驟：1)制備嗜熱屬真菌的原生質體溶液；2)將所述原生質體溶液與同源重組片段混合，得到第一混合物；3)將所述第一混合物進行第一次冰浴，然后加PTC轉化液，培養，然后再進行第二次冰浴，得到第二混合物；4)將所述第二混合物涂布在固體培養基上培養，得到至少一個待鑒定的轉化子；5)將所述至少一個待鑒定的轉化子進行傳代培養，獲得傳代培養產物，并對所述傳代培養產物進行DNA水平上的鑒定，以篩選出所述嗜熱屬真菌的陽性轉化子。

技術領域

本申請提供了一種獲得嗜熱屬真菌陽性轉化子的方法。

背景技術

嗜熱屬(Thermomyces)真菌是一群適宜在40℃至50℃溫度下生長的真菌類群，其最低生長溫度為20℃，最高生長溫度可達60℃。目前國內外圍繞嗜熱真菌研究較多集中在其產生的熱穩定性木聚糖酶、熱穩定性幾丁質酶和脂肪酶等，而真菌作為產生新型活性化合物的重要資源，生長在極端環境中的真菌代表嗜熱真菌中的次生代謝產物的相關研究卻極少。2012年，郭繼鵬等人從嗜熱杜邦菌(Thermomyces dupontii)NRRL 2155中分離得到六個新骨架PKS-NRPS雜合生源十三元大環內酯類化合物Thermolides A-F，而且其中兩個化合物表現出極強的毒殺線蟲作用，與殺線蟲生物農藥阿維菌素相當，具有毒殺線蟲藥物開發前景。

雖然真菌具有產生新型活性化合物的巨大潛力。然而，由于嗜熱屬真菌的遺傳轉化一直以來是本領域的一項技術難題，目前尚未有采用原生質體轉化法應用于嗜熱真菌生物合成基因研究的報道。受遺傳操作、培養條件、檢測手段等限制，使目標化合物的發掘、生物合成途徑的深入研究、進行理性設計和定向合成變得較為困難。真菌遺傳轉化技術的建立和應用將對其次生代謝產物的研究與開發提供重要支持。

因此，建立一種簡單、高效、穩定的遺傳轉化方法將對嗜熱屬真菌的分子生物學研究，如重要生物合成基因、次生代謝產物的研究與開發提供重要基礎。

發明內容

本申請提供了一種獲得嗜熱屬(Thermomyces)真菌陽性轉化子的方法，其包括如下步驟：

1)制備嗜熱屬真菌的原生質體溶液；

2)將所述原生質體溶液與同源重組片段混合，得到第一混合物；

3)將所述第一混合物進行第一次冰浴，然后加PTC轉化液，培養，然后再進行第二次冰浴，得到第二混合物；

4)將所述第二混合物涂布在原生質體再生固體培養基上培養，得到至少一個待鑒定的轉化子；

5)將所述至少一個待鑒定的轉化子在用于菌絲生長的培養基(例如富營養培養基)上進行傳代培養，獲得傳代培養產物，并對所述傳代培養產物進行DNA水平上的鑒定，以篩選出所述嗜熱屬真菌的陽性轉化子。

在一個具體實施方式中，嗜熱屬真菌為嗜熱杜邦菌(Thermomyces dupontii)和/或嗜熱棉毛菌(Thermomyces lanuginosus)。

在一個具體實施方式中，嗜熱屬真菌為嗜熱杜邦菌(Thermomyces dupontii)NRRL2155和/或嗜熱棉毛菌(Thermomyces lanuginosus)ATCC 200065。

在一個具體實施方式中，所述同源重組片段中含有報告基因表達盒，并且在此情況下，在步驟4)中，將所述第二混合物涂布在原生質體再生固體培養基上培養15至20h后，在所述原生質體再生固體培養基上覆蓋一層含有所述報告基因選擇壓的所述原生質體再生固體培養基，繼續培養，得到至少一個待鑒定的轉化子；在步驟5)中，將所述至少一個待鑒定的轉化子在含有所述報告基因選擇壓的用于菌絲生長的培養基(例如富營養培養基)上進行傳代培養，獲得傳代培養產物，并對所述傳代培養產物進行DNA水平上的鑒定，以篩選出所述嗜熱屬真菌的陽性轉化子。