[發明專利]一種獲得嗜熱屬真菌陽性轉化子的方法

有效

• 申請號: 201810449674.8
• 申請日: 2018-05-11
• 公開（公告）號: CN108611283B
• 公開（公告）日: 2022-03-15
• 發明（設計）人: 牛雪梅;何佳寧;張克勤
• 申請（專利權）人: 云南大學
• 主分類號: C12N1/15
• 分類號: C12N1/15;C12N15/90;C12R1/645
• 代理公司: 北京聿華聯合知識產權代理有限公司 11611
• 代理人: 劉烽

1.一種獲得嗜熱屬(Thermomyces)真菌陽性轉化子的方法，其包括如下步驟：

1)制備原生質體的濃度為1×10⁸個/mL的嗜熱屬真菌的原生質體溶液；

2)將所述原生質體溶液與同源重組片段混合，得到第一混合物，其中，每200μL的所述原生質體溶液使用所述同源重組片段的量為10μg至15μg；

3)將所述第一混合物進行第一次冰浴，然后加PTC轉化液，培養30min至50min，然后再進行第二次冰浴，得到第二混合物；

4)將所述第二混合物涂布在原生質體再生固體培養基上培養，得到至少一個待鑒定的轉化子；

5)將所述至少一個待鑒定的轉化子在用于菌絲生長的培養基上進行傳代培養，獲得傳代培養產物，并對所述傳代培養產物進行DNA水平上的鑒定，以篩選出所述嗜熱屬真菌的陽性轉化子；

所述原生質體溶液的制備方法包括以下步驟：

1-1)將所述嗜熱屬真菌接種于用于菌絲生長的固體培養基上，培養6至8天，獲得5×10⁷個/mL至5×10⁸個/mL的孢子懸浮液；

1-2)以0.5‰至10‰的量將所述孢子懸浮液接種至YPS液體培養基中，在180rpm至200rpm下震蕩培養18h至24h，獲得菌絲培養物；

1-3)將所述菌絲培養物過濾后，收集菌絲體；

1-4)將所述菌絲體用P緩沖液洗滌至少一次；

1-5)將所述菌絲體置于酵母破壁酶滲透液中，得到酶解體系，所述酶解體系在28℃至30℃以及80rpm至100rpm的條件下酶解5h至5.5h，得到裂解產物；其中，酵母破壁酶滲透液中含有酵母破壁酶、N緩沖液和P緩沖液，且N緩沖液和P緩沖液的體積比為(2.5-3.5)：(16.5-17.5)；在所述酶解體系中的菌絲體的濃度為75mg/mL至125mg/mL，在所述酶解體系中的酵母破壁酶的濃度為15mg/mL至20mg/mL；

1-6)將所述裂解產物過濾，收集形成的原生質體并用酶終止液終止酶解反應，得到裂解物溶液；

1-7)將所述裂解物溶液在4℃至6℃以及4000rpm至6000rpm下離心8min至10min，棄去第一上清液，之后用STC溶液懸浮第一離心沉淀物，得到第一STC懸浮液；將所述第一STC懸浮液在4℃至6℃以及4000rpm至6000rpm下離心8min至10min，棄去第二上清液，再次用STC溶液懸浮第二離心沉淀物，得到第二STC懸浮液；將所述第二STC懸浮液在4℃至6℃以及4000rpm至6000rpm下離心8min至10min，棄去第三上清液之后，用STC溶液將第三離心沉淀物調至終濃度為1×10⁸個/mL的原生質體溶液；

其中，

所述P緩沖液的配方如下：MgSO₄·7H₂O 39.435g，檸檬酸鈉11.764g，加入150mL蒸餾水溶解后，調pH值＝5.5，定容至200mL；

所述N緩沖液的配方如下：山梨醇9.105g，檸檬酸鈉0.735g，加入30mL蒸餾水，溶解后，調至pH值＝5.8，定容至50mL。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，嗜熱屬真菌為嗜熱杜邦菌(Thermomyces dupontii)和/或嗜熱棉毛菌(Thermomyces lanuginosus)。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述同源重組片段中含有報告基因表達盒，并且在此情況下，在步驟4)中，將所述第二混合物涂布在原生質體再生固體培養基上培養15至20h后，在所述原生質體再生固體培養基上覆蓋一層含有所述報告基因選擇壓的所述原生質體再生固體培養基，繼續培養，得到至少一個待鑒定的轉化子；在步驟5)中，將所述至少一個待鑒定的轉化子在含有所述報告基因選擇壓的用于菌絲生長的培養基上進行傳代培養，獲得傳代培養產物，并對所述傳代培養產物進行DNA水平上的鑒定，以篩選出所述嗜熱屬真菌的陽性轉化子。