[發明專利]一種有利于桑黃中黃酮類物質富集的液體發酵培養方法

在審

• 申請號: 201810449464.9
• 申請日: 2018-05-11
• 公開（公告）號: CN108611381A
• 公開（公告）日: 2018-10-02
• 發明（設計）人: 王晶;師粒晶;張勇;李福森;劉春明
• 申請（專利權）人: 長春師范大學
• 主分類號: C12P17/06
• 分類號: C12P17/06;C12R1/645
• 代理公司: 北京華仲龍騰專利代理事務所(普通合伙) 11548
• 代理人: 李靜

1.一種有利于桑黃中黃酮類物質富集的液體發酵培養方法，其特征在于，包括母種制備和桑黃液體培養，母種制備的具體步驟如下：

步驟一，PDA培養基配方包括土豆180-210g、葡萄糖17-22g，再用蒸餾水定容至1L，pH自然值，按照配方制作培養基，各自分裝于250mL的錐形瓶中，做好分類標記，用三角瓶封口膜封口，再外扎一層牛皮紙，與其他待滅菌的實驗器具一同放入高壓蒸汽滅菌鍋，115-125℃下滅菌20-28min，降至室溫后，放入超凈工作臺，紫外照射15-20min；

步驟二，取生長于固體斜面且生長狀況優良的桑黃菌種，在超凈工作臺中用接種鏟取1mm²的菌塊接種于裝有PDA液體培養基的培養瓶中，放入25-28℃以及轉速為150-210轉/分鐘的恒溫振蕩培養箱中；

步驟三，24小時內培養基中的菌塊周圍出現了細微的白色菌絲，培養基顏色為淡黃色；72小時內培養基中的菌塊變成外周為細密白色菌絲的菌球，培養基顏色為黃色；培養至第五天，菌球數量增加，培養基顏色為深黃色，此時在超凈工作臺中向培養瓶中加入高壓滅菌過的磁力轉子，將培養瓶置于磁力攪拌器上，攪拌速度為1500-1800轉/分鐘、溫度為25-28℃并且用黑紙遮蓋培養；

步驟四，24小時后菌液呈黃褐色，菌絲均勻分布于菌液中并且無污染現象，繼續攪拌培養，轉速調至1200-1350轉/分鐘，培養過夜，觀察菌液的顏色呈棕褐色，菌液面出現白色浮泡，即液態桑黃母種制備完成，可以進行定量接種；

桑黃液體培養的具體步驟如下：

步驟一，取土豆180-210g、葡萄糖17-22g、蛋白胨并且用蒸餾水定容至1L，蛋白胨的最終濃度為2-8g/L，PH自然值，制作培養基，各自分裝于250mL的錐形瓶中，高溫滅菌，放置常溫，紫外消毒；

步驟二，在超凈工作臺中對液體培養基接入取桑黃母液500ul進行接種，置于25-28℃以及轉速為150-180轉/分鐘的振蕩培養箱中培養，72小時各培養基中的情況菌球有8-12個，直徑在1.7-1.9cm，菌體顏色深黃色，培養一周后各培養基中菌球有35-45個，直徑在0.7-0.9cm，菌體顏色黃褐色；

步驟三，培養15天，菌絲均已成熟，對培養液進行過濾，菌絲體過濾后裝至小錐形瓶，封上過濾膜，放入零下85-零下75℃的冰箱，待冷凍干燥；

步驟四，稱取菌絲體重量為0.5030-0.5320g，加入質量分數為95%的乙醇10 mL中并且放置于離心管，超聲50-75min，溫度為66-78℃，離心8-12 min，取濾液進行旋轉蒸發，加入2mL的色譜甲醇溶解，得到成品。

2.根據權利要求1所述的有利于桑黃中黃酮類物質富集的液體發酵培養方法，其特征在于，所述母種制備步驟一中紫外照射的功率為45-60μW/cm²。

3.根據權利要求1或2所述的有利于桑黃中黃酮類物質富集的液體發酵培養方法，其特征在于，所述桑黃液體培養的步驟一中高溫滅菌的溫度為136-150℃，紫外消毒的功率為55-75μW/cm²。

4.根據權利要求1-3任一所述的有利于桑黃中黃酮類物質富集的液體發酵培養方法，其特征在于，所述桑黃液體培養的步驟四中超聲功率為60-80W，超聲頻率為20-25KHz。