[發明專利]表達豬流行性腹瀉病毒S基因的豬源BVDV重組病毒及應用

在審

• 申請號: 201810447166.6
• 申請日: 2018-05-11
• 公開（公告）號: CN108611329A
• 公開（公告）日: 2018-10-02
• 發明（設計）人: 劉惠莉;陶潔;李本強;程靖華;石迎;饒柏鐘
• 申請（專利權）人: 上海市農業科學院
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/85;C12R1/93
• 代理公司: 上海開祺知識產權代理有限公司 31114
• 代理人: 張曉敏;費開逵

1.表達豬流行性腹瀉病毒S基因的豬源BVDV重組病毒，其在豬源BVDV的C核衣殼蛋白N端插入了豬流行性腹瀉病毒S基因的中和抗原表位序列。

2.根據權利要求1所述表達豬流行性腹瀉病毒S基因的豬源BVDV重組病毒，其特征在于，豬流行性腹瀉病毒S基因的中和抗原表位序列的插入位點為豬源BVDV的C核衣殼蛋白N端的第7和第8個氨基酸之間。

3.根據權利要求1所述表達豬流行性腹瀉病毒S基因的豬源BVDV重組病毒，其特征在于，其基因序列如SEQ ID NO.1所示。

4.一種含有權利要求1所述重組病毒基因的豬源BVDV重組感染性克隆質粒。

5.根據權利要求4所述的豬源BVDV重組感染性克隆質粒，其特征在于，所述質粒為pASH-dS312。

6.如權利要求4所述豬源BVDV重組感染性克隆質粒的應用，所述豬源BVDV重組感染性克隆質粒線性化后，體外轉錄成RNA，并轉染MDBK細胞，拯救出表達豬流行性腹瀉病毒S蛋白的豬源BVDV重組病毒。

7.如權利要求4所述豬源BVDV重組感染性克隆質粒的構建方法，包括如下步驟：

1)根據豬源BVDV感染性克隆質粒的序列和PEDV流行株的S基因序列，設計重疊延伸PCR引物；

2)利用重疊延伸PCR方法，將PEDV S基因中長度為312bp的抗原表位片段串聯在一起，獲得dS312片段；

3)將dS312片段插入豬源BVDV感染性克隆質粒，插入位點為豬源BVDV感染性克隆質粒的C核衣殼基因N端第7和第8個氨基酸之間，獲得豬源BVDV重組感染性克隆質粒。

8.根據權利要求7所述豬源BVDV重組感染性克隆質粒的構建方法，其特征在于，所述豬源BVDV感染性克隆質粒為pASH28。

9.根據權利要求8所述豬源BVDV重組感染性克隆質粒的構建方法，其特征在于，步驟3)中，獲得的豬源BVDV重組感染性克隆質粒為pASH-dS312。

10.根據權利要求7所述豬源BVDV重組感染性克隆質粒的構建方法，其特征在于，步驟1)中，所述重疊延伸PCR引物包括四對引物對，分別為：XhoI-F和COE-R1、COE1-F1和COE1-R1、COE2-F2和COE2-R2、COE-F3和PmlI-R，從5’端到3’端，引物對的具體序列如下：

XhoI-F：GGAAGTCGTCAATGGTTCG；

COE-R1：TGATGGCAAAGTACCCTTACCCCCTTC；

COE1-F1：AGGGGGTAAGGGTACTTTGCCATCATTC；

COE1-R1：TGATGGCAAAGTGTAACCAAAAAGAT；

COE2-F2：CTTTTTGGTTACACTTTGCCATCATTCA；

COE2-R2：CCCTTCATCAGAGTAACCAAAAAGAT；

COE-F3：TCTTTTTGGTTACTCTGATGAAGGG；

PmlI-R：GTTTGTTCCACTCATGCCTTTG。