[發(fā)明專利]牛脊髓DNA鑒定試劑盒及鑒定方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810446159.4
• 申請(qǐng)日: 2018-05-11
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108456736A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-08-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫麗媛;李明成;艾金霞;趙云冬;王艷雙;王雪松;高麗君
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北華大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/6888
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/6888;C12Q1/686
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

本發(fā)明涉及中藥檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，是一種牛脊髓DNA鑒定試劑盒，其特征是由樣本前處理液、線粒體DNA提取體系、PCR反應(yīng)體系三部分體系組成。PCR反應(yīng)體系總體系為20μL，其中含有Taq Plus PCR Master Mix 10μL，10mM牛脊髓引物1μL，待測(cè)樣品DNA1μL，無(wú)菌雙蒸餾水8μL。一種牛脊髓DNA鑒定方法是設(shè)計(jì)牛脊髓特異寡核苷酸引物、確定反應(yīng)程序和結(jié)果判定等步驟。判斷標(biāo)準(zhǔn)：PCR擴(kuò)增結(jié)果出現(xiàn)254bp條帶為正品牛脊髓，出現(xiàn)多條或不出現(xiàn)均為偽品牛脊髓，鑒定方法能夠準(zhǔn)確鑒定牛脊髓真?zhèn)巍?/p>

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及使用生物技術(shù)鑒定牛脊髓與其易混品種（羊髓、豬髓、驢髓）DNA鑒定試劑盒及鑒定方法。

背景技術(shù)

牛脊髓是?？苿?dòng)物黃?；蛩５墓撬?。牛脊髓含有蛋白質(zhì)、脂肪、灰分、維生素B1、維生素B2、尼克酸，其脂肪酸含月桂酸、肉豆酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸等。牛脊髓滋肺補(bǔ)腎、填精益髓的功效始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》“主治腎精不足，虛勞贏瘦，骨痿無(wú)力等；肺腎陰虛，口渴多飲，皮膚干燥，手足皸裂等”。

牛脊髓是吉林金復(fù)康藥業(yè)有限公司的益血生膠囊（國(guó)藥準(zhǔn)字Z19983056，執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)為中國(guó)藥典2015年版一部）的生髓主要成分；也是血寶膠囊的主要成分（執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)為衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第八冊(cè)），生產(chǎn)企業(yè)有吉林白山正茂藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z22024266；國(guó)藥集團(tuán)宜賓制藥有限責(zé)任公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z51020067；山西華康藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z14020383；健民集團(tuán)葉開(kāi)泰國(guó)藥(隨州)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z42021922。

市場(chǎng)上的混用品種有羊髓、驢髓和豬髓等。特別是近年由于資源嚴(yán)重減少，價(jià)格一直持上升趨勢(shì)，使得一些偽品和混淆品大量出現(xiàn)，嚴(yán)重?cái)噥y了正常的市場(chǎng)秩序，危害了患者的身體健康。

常用的牛脊髓鑒別方法有藥材性狀鑒別、顯微鑒別和化學(xué)鑒別法。性狀鑒別主要是指從牛脊髓的外形、顏色、質(zhì)地、斷面特征、氣味等宏觀特征來(lái)判斷品種。方法雖然簡(jiǎn)單，但經(jīng)驗(yàn)在這種方法中的影響很大，主觀性較強(qiáng)。即使進(jìn)行了很詳細(xì)的性狀描述，再由其他人來(lái)判斷也比較難。而且作為藥材，其形態(tài)通常是不完整的，因此鑒定難度較大。

應(yīng)用分子遺傳標(biāo)記技術(shù)鑒定牛脊髓具有種屬特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高，重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，能從分子水平解決中藥宏觀鑒定的局限，利于中藥鑒定的標(biāo)準(zhǔn)化和國(guó)際化。

線粒體是存在于真核細(xì)胞內(nèi)的一種細(xì)胞器，線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）是一共價(jià)閉合的雙鏈環(huán)狀的遺傳物質(zhì)，具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、易于分離、拷貝數(shù)高、突變率高、進(jìn)化速度快、母性遺傳、無(wú)組織特異性、高保守性等特點(diǎn)。分析種內(nèi)和近緣種間遺傳多樣性和進(jìn)化關(guān)系的適當(dāng)DNA片段，可應(yīng)用于生物的分類(lèi)、系統(tǒng)發(fā)育和遺傳多樣性的研究。因此，以線粒體DNA分子特征為遺傳標(biāo)記的中藥鑒定更為準(zhǔn)確、可靠。

目前國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中尚無(wú)牛脊髓的法定鑒別方法，國(guó)內(nèi)亦無(wú)牛脊髓真?zhèn)舞b定的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)告。本發(fā)明專利基于選擇牛的mtDNA特異位點(diǎn)用于牛脊髓鑒別。從牛類(lèi)線粒體DNA的全部基因組進(jìn)行篩選，采用高通量技術(shù)分析具有鑒別序列片段作為鑒別點(diǎn)，建立PCR反應(yīng)體系，因無(wú)需對(duì)牛脊髓原藥成分進(jìn)行逐一分離，方法可快速、簡(jiǎn)便，在不失原藥材本性的條件下直接判斷牛脊髓的真?zhèn)巍?/p>

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明專利采用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)黃牛的線粒體DNA基因組進(jìn)行分析，利用Genbank中的相關(guān)信息，根據(jù)黃牛與其他相關(guān)動(dòng)物的線粒體DNA序列的差異，選取特異性靶基因序列，應(yīng)用primer 5.0設(shè)計(jì)軟件，利用PCR技術(shù)在一個(gè)反應(yīng)體系中加入一對(duì)特異性引物，針對(duì)一個(gè)模板可擴(kuò)增一個(gè)具有差異的目的片段，可有效地區(qū)分黃牛和偽品的特異性DNA序列。使用方便的牛脊髓和偽品PCR檢測(cè)試劑盒，能夠準(zhǔn)確鑒別牛脊髓和偽品特異性分子標(biāo)志，具有節(jié)省時(shí)間、降低成本和提高效率的特點(diǎn)，并提供其簡(jiǎn)便、快速、檢測(cè)結(jié)果可靠的鑒定方法。

本發(fā)明的目的是由以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：