[發(fā)明專利]牛脊髓DNA鑒定試劑盒及鑒定方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810446159.4
• 申請(qǐng)日: 2018-05-11
• 公開（公告）號(hào): CN108456736A
• 公開（公告）日: 2018-08-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫麗媛;李明成;艾金霞;趙云冬;王艷雙;王雪松;高麗君
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北華大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6888
• 分類號(hào): C12Q1/6888;C12Q1/686
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

1.一種鑒別牛脊髓和偽品PCR檢測(cè)試劑盒，它包含：

（1）樣本前處理液

主要含有蔗糖，Tris-HCl，Na₂EDTA；

（2）線粒體DNA提取體系

包括裂解液、沉淀液、洗滌液；

（3）PCR反應(yīng)體系

鑒定反應(yīng)體系 總體系為20μL，其中含有Taq Plus PCR Master Mix 10μL，10mM牛脊髓引物1μL，待測(cè)樣品DNA1μL，無(wú)菌雙蒸餾水8μL；

陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)體系 總體系為20μL，其中含有Taq Plus PCR Master Mix 10μL，10mM牛脊髓引物1μL，牛脊髓DNA1μL，無(wú)菌雙蒸餾水8μL；

陰性對(duì)照反應(yīng)體系 總體系為20μL，其中含有Taq Plus PCR Master Mix 10μL，10mM牛脊髓引物1μL，無(wú)菌雙蒸餾水9μL；

設(shè)計(jì)反應(yīng)程序 分別將鑒別牛脊髓和偽品PCR檢測(cè)試劑盒的鑒定反應(yīng)體系、陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)體系和陰性對(duì)照反應(yīng)體系的總體系各20μL加入反應(yīng)管中，置于PCR反應(yīng)儀中按下列程序進(jìn)行：94℃預(yù)變性5min，94℃ 30s，退火溫度56℃30s，72℃30s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min，4℃1h；

（4）結(jié)果判定體系

制備1.5%瓊脂糖凝膠，電壓85V電泳，DNA Marker為100bp DNA Ladder（標(biāo)準(zhǔn)分子量，市場(chǎng)有售）作參照，凝膠成像分析系統(tǒng)觀察和分析結(jié)果。

2.牛脊髓DNA鑒定方法，它包含以下步驟：

（1）樣本前處理

（2）線粒體DNA提取

（3）PCR引物設(shè)計(jì)與合成

設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增牛脊髓DNA片段的引物如下，引物由深圳華大基因科技服務(wù)有限公司合成mtDNA特異性引物，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物為254bp；

Primer F：5′CATCAAACATCTCATCTTGATG3′

Primer R：5′AGTGTAAGACCCGTAATATAAG3′

（4）建立PCR反應(yīng)

鑒定反應(yīng)體系 總體系為20μL，其中含有Taq Plus PCR MasterMix 10μL，10mM牛脊髓引物1μL，待測(cè)樣品DNA1μL，無(wú)菌雙蒸餾水8μL；

陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)體系 總體系為20μL，其中含有Taq Plus PCR MasterMix 10μL，10mM牛脊髓引物1μL，牛脊髓DNA1μL，無(wú)菌雙蒸餾水8μL；

陰性對(duì)照反應(yīng)體系 總體系為20μL，其中含有Taq Plus PCR MasterMix 10μL，10mM牛脊髓引物1μL，無(wú)菌雙蒸餾水9μL；

設(shè)計(jì)反應(yīng)程序 分別將鑒別牛脊髓和偽品PCR檢測(cè)試劑盒的鑒定反應(yīng)體系、陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)體系和陰性對(duì)照反應(yīng)體系的總體系各20μL加入反應(yīng)管中，置于PCR反應(yīng)儀中，按下列程序進(jìn)行: 94℃預(yù)變性5min，94℃ 30s，退火溫度56℃ 30s，72℃30s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min，4℃1h；

（5）結(jié)果判定

制備1.5%瓊脂糖凝膠，電壓85V電泳，DNA Marker為100bp DNA Ladder（標(biāo)準(zhǔn)分子量，市場(chǎng)有售）作參照，凝膠成像分析系統(tǒng)觀察和分析結(jié)果，出現(xiàn)254bp 條帶為正品牛脊髓，出現(xiàn)多條或不出現(xiàn)均為偽品牛脊髓，參照?qǐng)D1。

3.如權(quán)利要求1所述的牛脊髓DNA鑒定試劑盒或權(quán)利要求2所述的牛脊髓DNA鑒定方法，其特征是，所述方法或試劑盒中的牛脊髓為牛科動(dòng)物黃牛或水牛的骨髓。

4.如權(quán)利要求2 所述的牛脊髓DNA鑒定方法，其特征是，結(jié)果鑒定是利用比較樣品PCR擴(kuò)增片段DNA 大小與DNA 標(biāo)準(zhǔn)分子量的相同，根據(jù)出現(xiàn)判定標(biāo)準(zhǔn)完全一致對(duì)牛脊髓樣品進(jìn)行真?zhèn)舞b定。

5.如權(quán)利要求1所述的牛脊髓DNA鑒定試劑盒或權(quán)利要求2所述的牛脊髓DNA鑒定方法在牛脊髓樣品的真?zhèn)舞b定中的應(yīng)用。