[發(fā)明專利]一種基于LAMP快速檢測(cè)蘋果輪紋病菌的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810443208.9
• 申請(qǐng)日: 2018-05-10
• 公開（公告）號(hào): CN108754004A
• 公開（公告）日: 2018-11-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 汪少麗;王英姿;王培松;劉保友;欒炳輝
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東省煙臺(tái)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院
• 主分類號(hào): C12Q1/6895
• 分類號(hào): C12Q1/6895;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 煙臺(tái)雙聯(lián)專利事務(wù)所(普通合伙) 37225
• 代理人: 張?jiān)鲚x

本發(fā)明公開了一種蘋果輪紋病菌LAMP檢測(cè)引物及其應(yīng)用。一種基于LAMP技術(shù)檢測(cè)蘋果輪紋病菌的引物組合物由6條特異性引物F3、B3、FIP、BIP、LF、LB組成。本發(fā)明還提供了一種蘋果輪紋病菌LAMP檢測(cè)方法,包括以下步驟:1)提取待測(cè)樣品DNA;2)使用本發(fā)明提供的引物組合物對(duì)待測(cè)樣品DNA進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增;3)結(jié)果檢測(cè),顯色結(jié)果觀察到綠色熒光或電泳出現(xiàn)梯形條帶的判斷為陽性,顯色橙色或橘黃色或沒出現(xiàn)梯形條帶的判斷為陰性。本發(fā)明為蘋果輪紋病菌提供了新的分子檢測(cè)方法及引物組合物,能快速、方便、高效、高特異、高靈敏地檢測(cè)到蘋果輪紋病菌,為蘋果輪紋病菌的早期診斷、檢測(cè)及進(jìn)出口快速檢測(cè)提供可靠的技術(shù)和理論依據(jù)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于農(nóng)作物病害檢測(cè)、鑒定及防治技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種蘋果輪紋病菌LAMP檢測(cè)引物及其應(yīng)用。可用于蘋果輪紋病菌快速、靈敏和特異的分子檢測(cè),同時(shí)可用于蘋果輪紋病的早期診斷和病菌的監(jiān)測(cè)和鑒定。

背景技術(shù)

蘋果(Malus sieversii(Led.)Roem.)果實(shí)營養(yǎng)豐富,含有豐富的鋅，素有“智慧果”、“記憶果”的美稱，蘋果中還含有豐富的蛋白質(zhì)、多酚、維生素C等營養(yǎng)物質(zhì)。不僅如此，蘋果氣味芬芳，口感香甜是深受廣大生產(chǎn)者和消費(fèi)者喜愛的高經(jīng)濟(jì)價(jià)值作物。

蘋果輪紋?。?Italic>Botryosphaeria dothidea）在蘋果的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)栽培中成為制約產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因子，近年來隨著易感品種富士蘋果的大面積種植，蘋果輪紋病發(fā)病率逐年升高，危害面積不斷擴(kuò)大，已成為中國蘋果生產(chǎn)中的重要病害，嚴(yán)重威脅蘋果產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。輪紋病菌主要危害枝干和果實(shí)，當(dāng)侵染枝干后病菌在皮層組織內(nèi)迅速擴(kuò)展，造成主干大枝樹皮粗糙，形成粗皮病，削弱樹勢(shì)。果實(shí)受害產(chǎn)生深淺相間的同心輪紋狀病斑，其外緣有明顯的水漬圈，果實(shí)酸臭腐爛，從而導(dǎo)致蘋果降低品質(zhì)失去商品價(jià)值。然而,針對(duì)此病尚無較好的抗病品種且輪紋病菌的潛伏期較長，早期難以通過肉眼觀察癥狀被發(fā)現(xiàn)，因此,快速、準(zhǔn)確地在發(fā)病前或初期對(duì)病菌的侵染動(dòng)態(tài)進(jìn)行監(jiān)測(cè),及時(shí)采取有效的防治方法對(duì)控制病害在田間和儲(chǔ)運(yùn)中的發(fā)生,以及進(jìn)出口蘋果的快速檢測(cè)中具有十分重要的意義。

傳統(tǒng)輪紋病菌的分類與鑒定主要基于形態(tài)學(xué)特征及致病性測(cè)定等,這種鑒定方法耗時(shí)較長、程序繁瑣、靈敏度低以及經(jīng)驗(yàn)性強(qiáng),從發(fā)病植株中分離并鑒定病原菌需要數(shù)天時(shí)間,難以做到對(duì)病害發(fā)生及時(shí)監(jiān)測(cè)和有效控制病原菌的傳播與病害流行。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,應(yīng)用PCR、血清免疫學(xué)等技術(shù)對(duì)病原菌進(jìn)行特異和快速分子檢測(cè)的成功例子已越來越多,但這些分子生物學(xué)技術(shù)在一定程度上也存在了一些不足之處。如血清免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)在血清的制備過程耗時(shí)耗力,常常受到抗血清質(zhì)量的影響,且可能存在交叉反應(yīng),特異性較差,容易造成假陽性;PCR快速檢測(cè)技術(shù)主要包括常規(guī)PCR、巢式PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR等技術(shù),但這些PCR技術(shù)檢測(cè)時(shí)間較長,需要依靠PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)等貴重儀器設(shè)備,不利于基層生產(chǎn)上推廣應(yīng)用,上述缺欠限制了這些先進(jìn)方法的推廣應(yīng)用。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediated Isothermal Amplification,LAMP)技術(shù)是由日本榮研公司開發(fā)的一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確及廉價(jià)的核酸高效擴(kuò)增技術(shù),該技術(shù)可在60℃-65℃恒溫條件下,利用高活性的鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)對(duì)目的DNA片段進(jìn)行特異性擴(kuò)增。在1小時(shí)內(nèi)就能夠?qū)⑸倭靠截悢?shù)的目的基因擴(kuò)增至10⁹-10¹⁰個(gè)拷貝數(shù)。LAMP反應(yīng)產(chǎn)物不僅可以通過濁度儀、real-time PCR儀及凝膠電泳儀進(jìn)行檢測(cè),而且還可以通過SYBR Green I、鈣黃綠素、羥基萘酚藍(lán)染色后,肉眼識(shí)別。由于LAMP反應(yīng)簡(jiǎn)單、快速、高效、經(jīng)濟(jì),且無需特殊設(shè)備,檢測(cè)結(jié)果可由肉眼判斷,極適合于在基層生產(chǎn)部門推廣應(yīng)用,因而具有極為廣泛的應(yīng)用前景。目前LAMP檢測(cè)主要應(yīng)用于人畜病原物、食品安全和環(huán)境衛(wèi)生的檢測(cè),在植物病原菌檢測(cè)中報(bào)道較少,關(guān)于蘋果輪紋病菌的LAMP檢測(cè)國內(nèi)外均未見報(bào)道。