[發(fā)明專利]一種基于LAMP快速檢測蘋果輪紋病菌的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810443208.9
• 申請日: 2018-05-10
• 公開（公告）號: CN108754004A
• 公開（公告）日: 2018-11-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 汪少麗;王英姿;王培松;劉保友;欒炳輝
• 申請（專利權(quán)）人: 山東省煙臺市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 煙臺雙聯(lián)專利事務(wù)所(普通合伙) 37225
• 代理人: 張增輝

1.蘋果輪紋病菌LAMP檢測引物,其特征在于,其核苷酸序列為:

F3: 5'- TGGGTGTTGGAGGGTGAT-3'

B3: 5'- TGGGAGGTGAAGGTTGAGAA-3'

FIP: 5'- GAGGGGGGAGGTGTTTGAGGTAGAAGGGTGAAGGTGTGGT-3'

BIP: 5'- GGGTGTTGGGTGAAGGGTAGTGTTGAGAAGGTTGGTGGGG-3'

LF：5'- GGAGGGTGGGGAATAGGA-3'

LB：5'- AGAAGATAGATGTGGGTTGGGAG-3'。

2.一種利用權(quán)利要求1所述引物進(jìn)行蘋果輪紋病菌LAMP檢測的方法,其特征在于,包括以下具體步驟:

(1)提取待測樣品基因組DNA；

(2)LAMP反應(yīng)體系的建立:LAMP檢測反應(yīng)體系為25μL,以步驟(1)提取的DNA為模板,反應(yīng)體系包括10μM F3和B3各0.5μL, 10μM FIP和BIP各2.0μL, 10μM LF和LB各1.0μL ，2XLAMP Master Mix反應(yīng)混合液12.5μL,8U Bst DNA聚合酶0.5μL,DNA模板1.0μL,用滅菌超純水補(bǔ)足至25μL，然后在反應(yīng)管蓋子內(nèi)加入顯色劑SYBR GreenI1.0μL；

(3)LAMP反應(yīng)條件:65℃溫育60 min,85℃滅活10 min；

(4)反應(yīng)結(jié)果的測定:采用熒光染料目測觀察法或瓊脂糖凝膠電泳法進(jìn)行測定。

3.如權(quán)利要求2所述的一種蘋果輪紋病菌LAMP檢測方法,其特征在于,

所述步驟（4）中， 采用熒光染料目測觀察法,待LAMP反應(yīng)結(jié)東后,瞬時離心使反應(yīng)管蓋子上的顯色劑SYBR GreenI加入反應(yīng)液中,顯色結(jié)果觀察到綠色熒光的判斷為陽性,橙色或橘黃色判斷為陰性。

4.如權(quán)利要求2所述的一種蘋果輪紋病菌LAMP檢測方法,其特征在于,

所述步驟（4）中，采用瓊脂糖凝膠電泳法,取5.0μL LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,如出現(xiàn)梯形條帶判斷為陽性,沒有出現(xiàn)條帶則判斷為陰性。

5.如權(quán)利要求2所述的一種蘋果輪紋病菌LAMP檢測方法,其特征在于,所述的2XLAMPMaster Mix反應(yīng)混合液由以下組分組成:40 mM Tris-HCl,20 mM (NH₄)₂SO₄,20 mM KC1,16mM MgSO₄,2.0 mM dNTPs,0.2% Trion X-100。

6.利用權(quán)利要求1所述的蘋果輪紋病菌LAMP檢測引物在蘋果輪紋病菌的早期診斷和病菌的監(jiān)測鑒定上的應(yīng)用。

7.利用權(quán)利要求2所述的蘋果輪紋病菌LAMP檢測方法在蘋果輪紋病菌的早期診斷和病菌的監(jiān)測、鑒定上的應(yīng)用。