[發明專利]一種基于微孔板的肌醇定量檢測方法

在審

• 申請號: 201810441370.7
• 申請日: 2018-05-10
• 公開（公告）號: CN108642125A
• 公開（公告）日: 2018-10-12
• 發明（設計）人: 段緒果;沈鎮炎;張心怡
• 申請（專利權）人: 南京林業大學
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04;C12R1/865
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

本發明公開了一種基于微孔板的肌醇定量檢測方法，屬于微生物檢測領域。本發明包括以下步驟：A.將檢測用菌復蘇復蘇菌種；B.將復蘇斜面菌種利用0.9％的無菌生理鹽水洗下，離心收集細胞再用0.9％的無菌鹽水懸浮細胞，震蕩混勻制備成菌基液；C.選取適量的菌基液利用0.9％的無菌鹽水進行稀釋，控制菌懸液濃度的吸光值在0.1～0.3之間，即為接種菌懸液；D.將肌醇標準溶液或待檢測的樣品溶液和無菌水按照一定比例加入微孔板中，再補充肌醇測定培養基；E.將接種菌懸液接種至微孔板中，并置于高速震蕩搖床中，震蕩培養14～17h；F.培養結束后利用酶標儀測定微孔板中菌液吸光值，繪制肌醇標準曲線并計算樣品中的肌醇含量。本發明具有成本低、操作簡單、檢測時間短和通量大等特點。

技術領域

本發明涉及一種基于微孔板的肌醇定量檢測方法，尤其是一種基于微孔板培養的高通量檢測食品中肌醇含量的方法，屬于微生物檢測領域。

背景技術

肌醇是含有6個碳的環多醇，醫學界將其劃分在維生素類，稱為維生素B8。肌醇及其衍生物和肌醇化合物存在于所有動物組織，在心臟和大腦中含量最高。目前肌醇被廣泛應用于醫藥工業、食品、飼料和日用化工等領域。大量實驗表明肌醇是一種必需的營養因子，人類和動物體內的肌醇可自身合成，但大多是來自于食物。對食品中肌醇含量的檢測已經成為食品檢測的一個重要指標。

肌醇定量分析方法主要有經典的質量法、高碘酸鈉法、高效液相色譜法、氣相色譜法和微生物法。質量法使用大量的三氯甲烷等對人體有害的物質，并且無法排除葡萄糖的影響；高碘酸鈉法僅適用于肌醇為主要成分的樣品測定，復雜樣品中葡萄糖和甘油等于肌醇結構類似或者官能團類似的有機成分會對測定結果影響很大；高效液相色譜法和氣相色譜法不僅需要昂貴的測定儀器、特定的色譜柱，還要通過繁雜的衍生化等技術，成本較高、操作較繁瑣；微生物法，利用葡萄汁酵母菌(ATCC-9080)對肌醇的特異性和靈敏性，定量測定出食品中肌醇的含量。與上述其它方法相比，微生物法具有快速、簡便、檢出限低、靈敏度高等優點，是食品安全國家標準(食品中肌醇的測定GB5009.270—2016)中的兩個推薦檢測方法之一。

現有的微生法測定肌醇方法主要包括以下步驟：1、接種斜面保存的菌種至新的麥芽浸粉瓊脂斜面培養基上并培養，得到復蘇菌種；2、將復蘇菌種轉接到麥芽浸粉培養基上，于規定的溫度下培養16-24h；3、利用接種環刮取菌苔于裝有生理鹽水的無菌離心管中，進行離心、清洗，如此清洗3-4次，吸取一定量的該菌液移入裝有10mL生理鹽水溶液中得到接種菌懸液，利用分光光度計，以生理鹽水作空白，控制該菌液的在550nm下的透光率在60％～80％；4、最后取接種菌懸液接種至含有肌醇測定培養基和肌醇標準工作液或待測樣品的培養管中(培養液總體積為10mL)，培養22-24h，取培養細胞懸浮液，稀釋后測定吸光度，從而獲得肌醇標準曲線并計算待測樣品中肌醇含量。

現有微生物檢測方法存在以下問題：1、肌醇測定培養基的消耗很大，檢測成本較高。每支培養管中肌醇測定培養基的添加量均為5mL(成本約2元)，在檢測過程中，標準曲線測定需要10支培養管，每支需要消耗5mL肌醇測定培養基(成本約20元)；每個待測樣品國標中要求稀釋3個濃度，每個濃度做3個平行，單個樣品檢測需要消耗45mL肌醇測定培養基(樣品檢測成本約18元)。2、培養之后的檢測步驟繁瑣，所需時間較長。現有的肌醇檢測過程分為兩個階段：試管培養階段和分光光度計檢測階段。培養階段在培養管中進行，培養結束以后無法直接測定，需將試管中的培養菌液稀釋后，置于比色皿中逐個對樣品進行測定，樣品檢測過程繁瑣，時間長。3、檢驗所用的是酵母細胞，酵母細胞個體較大，極易發生沉降，菌液吸光度檢測步驟時間過長，容易影響檢驗結果的準確性和重復性。4、此外，由于檢測步驟較繁瑣，工作強度大，難以實現對大量樣品的高通量檢測。為解決上述問題，需要開發一種操作簡單、快速、成本低且容易實現高通量檢測的新方法。

發明內容

本發明的目的是提供一種利用微孔板檢測肌醇含量的方法，其具有容易操作、檢測時間短、成本低、高通量的特點。

本發明所述方法包括以下步驟：