[發明專利]一種基于微孔板的肌醇定量檢測方法

在審

• 申請號: 201810441370.7
• 申請日: 2018-05-10
• 公開（公告）號: CN108642125A
• 公開（公告）日: 2018-10-12
• 發明（設計）人: 段緒果;沈鎮炎;張心怡
• 申請（專利權）人: 南京林業大學
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04;C12R1/865
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

1.一種檢測肌醇含量的方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟A：復蘇肌醇檢測用菌；

步驟B：制備接種菌基液：將復蘇得到的檢測用菌以無菌鹽水多次洗滌后，加入到無菌鹽水中，制成菌基液；

步驟C：吸取適量的菌基液利用0.9％的無菌鹽水進行稀釋得到菌懸液，控制菌懸液600nm處吸光值在0.1～0.3之間，即為接種菌懸液；

步驟D：將肌醇標準溶液或待檢測的樣品溶液加入微孔板中，再補充肌醇測定培養基；

步驟E：取步驟C中的接種菌懸液接種至步驟D中的微孔板中，微孔板置于1200～1350r/min的高速震蕩搖床中，于30±1℃震蕩培養14～17h；

步驟F：對于在步驟D添加了肌醇標準溶液的微孔板，經步驟E的震蕩培養后，利用酶標儀于600nm處測定吸光值，并以吸光值為縱坐標，以肌醇含量為橫坐標繪制標準曲線；對于在步驟D添加了待檢測樣品溶液的微孔板，經步驟E的震蕩培養后，利用酶標儀于600nm處測定吸光值，根據標準曲線，計算樣品中的肌醇含量。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，肌醇檢測用菌為葡萄汁酵母菌ATCC-9080、、粟酒裂殖酵母、耐溫絮凝酵母等具有肌醇營養缺陷型的菌株中的一種。

3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，肌醇檢測用菌為葡萄汁酵母菌ATCC-9080。

4.根據權利要求1～3任一所述的方法，其特征在于，步驟C中，吸取適量的菌基液利用0.9％的無菌鹽水進行稀釋得到菌懸液，以無菌鹽水作空白，使用分光光度計測定600nm波長下所述菌懸液的吸光值，控制菌懸液吸光值在0.1～0.3之間，即為接種菌懸液。

5.根據權利要求1～4任一所述的方法，其特征在于，步驟E中單個微孔中的裝樣體積為150μL～300μL。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟E中單個微孔中的裝樣體積為200μL。

7.根據權利要求1～4任一所述的方法，其特征在于，步驟E中單個微孔中接入的菌懸液的體積是3μL～10μL.

8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，步驟E中單個微孔中接入的菌懸液的體積是5μL。

9.根據權利要求1～8任一所述的方法，其特征在于，

步驟A：將斜面保存的葡萄汁酵母菌ATCC-9080接種至新的麥芽浸粉瓊脂斜面培養基上并培養得到復蘇菌種；

步驟B：制備接種菌基液；

將步驟A的復蘇菌種利用0.9％的無菌鹽水洗下，離心收集細胞，再用0.9％的無菌鹽水重新懸浮細胞，再次收集菌體，重復清洗2-3次，再加入10mL無菌鹽水，震蕩混勻制備成菌基液；

步驟C：吸取適量的菌基液利用0.9％的無菌鹽水進行稀釋得到菌懸液，以無菌鹽水作空白，使用分光光度計測定600nm波長下所述菌懸液的吸光值，控制菌懸液吸光值在0.1～0.3之間，即為接種菌懸液；

步驟D：將肌醇標準溶液或者待檢測的樣品溶液加入微孔板中，補充肌醇測定培養基；

步驟E：取步驟B中的接種菌懸液接種至微孔板中，微孔板置于1350r/min的高速震蕩搖床，30±1℃震蕩培養14～17h；

步驟F：利用酶標儀于600nm處測定微孔板中含有肌醇標準溶液的微孔的吸光值，并以吸光值為縱坐標，以肌醇含量為橫坐標繪制標準曲線；以相同波長測定添加待檢測樣品溶液微孔的吸光值，根據標準曲線，計算樣品中的肌醇含量。