[發明專利]一種蓖麻原生質體制備和轉化方法

有效

• 申請號: 201810438350.4
• 申請日: 2018-05-09
• 公開（公告）號: CN108342351B
• 公開（公告）日: 2020-11-13
• 發明（設計）人: 劉穎;桑毅;胡漢橋;張力;張龍軍;勞永志;詹軍強
• 申請（專利權）人: 廣東海洋大學
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04;C12N15/82
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 朱雙;劉明星

本發明公開了一種蓖麻原生質體制備和轉化方法。本發明通過優化蓖麻葉片原生質體分離制備中葉片材料獲取時間、切取葉片的形狀、酶濃度、酶解時間和離心轉速等，并利用自制的簡易裝置過濾，獲得更多活力較強的原生質體，并利用本發明的方法成功的將外源質粒轉化蓖麻葉片原生質體，可以用于進一步的亞細胞定位。本發明為蓖麻功能基因的分析建立了一套高效的蓖麻葉片原生質體制備和轉化方法及亞細胞定位體系，利用這套體系可以高效的獲得蓖麻葉片原生質體，為獲得進行亞細胞定位提供了前提條件，進一步為蓖麻關鍵功能基因研究奠定了良好的工作基礎，為蓖麻原生質體的應用提供技術支持。

技術領域

本發明屬于植物生物技術領域，具體涉及一種蓖麻原生質體制備和轉化方法。

背景技術

原生質體(protoplast)一詞是Hanstein在1880年提出的，是指植物細胞去掉細胞壁而被原生質膜包裹的那部分裸露的物質。該裸露的物質具有其自身的全部遺傳信息，在適宜的條件下培養，可以再生成和其親本相似的個體；離體的原生質體具有廣泛的用途，不但能通過細胞的融合克服遠緣雜交不親和的障礙，而且是進行基因工程操作，尤其是進行基因的瞬時表達的理想受體，因此科學家們越來越重視原生質體的游離技術。

植物原生質體遺傳轉化常見的方法有基因槍法、農桿菌共培養轉化法、電擊穿孔轉化法和聚乙二醇(PEG)介導轉化法等。其中最常用的是PEG介導轉化法，該方法不僅成本低，操作簡單，而且還可以很大程度地保持原生質體的活性，是進行植物原生質體轉化的第一首選。其基本原理是：PEG帶有大量負電荷，可以與水分子以及Ca²⁺結合，并且連接原生質體表面的負電荷，形成靜電鍵，從而引起細胞質膜電荷紊亂甚至會產生微孔，使外源DNA可以通過這些孔隙進入細胞體內。植物種類、原生質體的活力與密度、質粒DNA的濃度與純度、PEG的分子量和濃度以及處理時間等均會影響轉化效率。目前為止由PEG介導的原生質體轉化技術在擬南芥和水稻等模式植物中逐漸趨于成熟，然而還有許多非模式植物尚未建立。

蓖麻是大戟科蓖麻屬一年生或多年生草本植物，是世界上十大油料作物之一，具有很高的經濟利用價值。目前有關蓖麻原生質體游離和轉化的研究還未見報道。

發明內容

本發明針對現有技術中無有關蓖麻原生質體制備和轉化方法的問題，提供一種操作簡便、能高效的獲得活力較強的蓖麻葉片原生質體的制備方法，及利用該原生質體進行遺傳轉化的方法。

本發明的蓖麻原生質體制備方法，包括以下步驟：

a.利用蓖麻完整的種子幼胚培養無菌苗，培養20天后，取葉片并吸干表面水分，舍去主葉脈部分，把葉片切成0.2mm寬細絲，然后將其浸沒于W5溶液中，加入酶解液，25℃、50rpm振蕩酶解80min；所述的酶解液，含有16g/L的纖維素酶RS、8g/L的離析酶R-10、 0.5M的甘露醇、20mM MES、10mM CaCl₂和1g/L的BSA，余量為水；

b.去掉酶解液，然后加入W5溶液漂洗酶解后的葉片細絲，收集漂洗后的溶液，利用原生質體過濾裝置過濾，收集過濾液，700rpm離心5min，倒去上清液，用W5溶液懸浮原生質體，再700rpm離心5min，倒去上清液，用W5溶液懸浮原生質體，再700rpm離心10min，去上清，沉淀即為蓖麻原生質體。

優選，所述的無菌苗的培養方法為：挑取成熟飽滿的蓖麻種子于蒸餾水中浸泡一天，剝去外殼，使用75體積分數％的乙醇水溶液浸泡1min，再使用質量分數2％的次氯酸鈉浸泡并震蕩10-15min，最后使用蒸餾水沖洗3-5次后，用無菌鑷子剝離蓖麻完整的幼胚接種于MS 基本培養基上，25±1℃、光照強度為2000lx、光照12h/黑暗12h的條件下培養。

優選，所述的W5溶液含有2mM MES、154mM NaCl、125mM CaCl₂和5mM KCl，余量為水。