[發(fā)明專利]一種蓖麻原生質(zhì)體制備和轉(zhuǎn)化方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810438350.4
• 申請日: 2018-05-09
• 公開（公告）號: CN108342351B
• 公開（公告）日: 2020-11-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉穎;桑毅;胡漢橋;張力;張龍軍;勞永志;詹軍強(qiáng)
• 申請（專利權(quán)）人: 廣東海洋大學(xué)
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04;C12N15/82
• 代理公司: 廣州科粵專利商標(biāo)代理有限公司 44001
• 代理人: 朱雙;劉明星

1.一種蓖麻原生質(zhì)體制備和轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，包括以下步驟：

a.利用完整的種子幼胚培養(yǎng)蓖麻無菌苗，培養(yǎng)20天后，取葉片并吸干表面水分，舍去主葉脈部分，把葉片切成0.2mm寬細(xì)絲，然后將其浸沒于W5溶液中10-20min后吸去W5溶液，加入酶解液，25℃、50rpm振蕩酶解80min；

所述的酶解液，含有16g/L的纖維素酶RS、8g/L的離析酶R-10、0.5M的甘露醇、20mMMES、10mM CaCl₂和1g/L的BSA，余量為水；所述的W5溶液，含有2mM MES、154mMNaCl、125mM CaCl₂和5mM KCl，余量為水；

b.去掉酶解液，然后加入W5溶液漂洗酶解后的葉片細(xì)絲，收集漂洗后的溶液，利用原生質(zhì)體過濾裝置過濾，收集過濾液，700rpm離心5min，倒去上清液，用W5溶液懸浮原生質(zhì)體，再700rpm離心5min，倒去上清液，用W5溶液懸浮原生質(zhì)體，再700rpm離心10min，去上清，沉淀即為蓖麻原生質(zhì)體；

所述的原生質(zhì)體過濾裝置是通過如下方法制備的：將兩層300目尼龍膜疊整齊后放置在一個底部為120目過濾網(wǎng)的茶漏上，再將另一個相同規(guī)格的茶漏放置在尼龍膜上，即制備得到原生質(zhì)體過濾裝置；

c.將制備得到的蓖麻原生質(zhì)體用MMG溶液懸浮，制備得到蓖麻原生質(zhì)體懸浮液；

所述的MMG溶液含有2mM MES、0.5mM甘露醇和15mM MgCl₂，余量為水；

d.向待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒中加入適量所述的蓖麻原生質(zhì)體懸浮液，加入等體積的PEG溶液，輕輕混勻，然后25℃、遮光培養(yǎng)15min；

所述的PEG溶液含有400g/L的PEG4000、0.2mM甘露醇和100mM CaCl₂，余量為水；

e.加入W5溶液對原生質(zhì)體進(jìn)行洗滌，700rpm離心10min，去掉上清收集沉淀，再用WI溶液懸浮原生質(zhì)體，25℃、遮光培養(yǎng)12h；然后700rpm離心10min，去除上清，沉淀中即含有成功轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體；

所述的WI溶液含有4mM MES、0.5mM甘露醇和20mM KCl，余量為水。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蓖麻原生質(zhì)體制備和轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，所述的無菌苗的培養(yǎng)方法為：挑取成熟飽滿的蓖麻種子于蒸餾水中浸泡一天，剝?nèi)ネ鈿ぃ褂皿w積分?jǐn)?shù)75％的乙醇水溶液浸泡1min，再使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2％的次氯酸鈉浸泡并震蕩10-15min，最后使用蒸餾水沖洗3-5次后，用無菌鑷子剝離蓖麻完整的幼胚接種于MS基本培養(yǎng)基上，25±1℃、光照強(qiáng)度為2000lx、光照12h/黑暗12h的條件下培養(yǎng)。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蓖麻原生質(zhì)體制備和轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，所述的用于蓖麻原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒是pUC18-35S-eGFP。