[發明專利]基于微流控芯片檢測游離三碘甲狀腺原氨酸fT3試劑盒及制備和檢測方法

在審

• 申請號: 201810437803.1
• 申請日: 2018-05-09
• 公開（公告）號: CN108931656A
• 公開（公告）日: 2018-12-04
• 發明（設計）人: 許行尚;杰弗瑞·陳;朱宗哲
• 申請（專利權）人: 南京嵐煜生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/78
• 分類號: G01N33/78;G01N33/532;G01N33/533
• 代理公司: 南京正聯知識產權代理有限公司 32243
• 代理人: 王素琴

1.一種基于微流控芯片的游離三碘甲狀腺原氨酸fT3試劑盒的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)微流控芯片包被：取游離三碘甲狀腺原氨酸fT3鼠單抗Anti-h T3 10550 1mg，加50mM pH9.6的CB緩沖液至1mL，按照單個芯片25uL加入微流控芯片反應腔室內，溫浴2小時后對芯片進行清洗；

(2)熒光微球標記：取游離三碘甲狀腺原氨酸fT3抗原Triiodothyronine加入至熒光微球溶液中，并渦旋混勻，其中，熒光微球是經過活化處理的，反應結束后，加入終止液對反應進行終止，后離心清洗，加入封閉液進行封閉，封閉后的熒光微球進行離心清洗，使用微球儲存液進行保存；

(3)微流控芯片組裝：向微流控芯片的反應腔室預先進行封閉處理，封閉液添加后在烘箱中進行烘干處理，在封閉后的中層芯片背部反應腔室下部內加入所述步驟(2)中的熒光微球溶液，于真空烘箱中真空干燥，熒光微球在芯片中呈現小液滴形態，不發生擴散；

芯片準備完畢后采用超聲鍵合的方式，依據芯片結構依次將濾血墊，加樣密封墊，導電橡膠，吸水紙以及密封圈加入芯片內部，將三層芯片按照超聲鍵合線完成合并；

(4)定標品的制備：定標品由A組分和B組分構成；

根據抗原濃縮液的估算濃度，用定標品稀釋液將抗原濃縮液稀釋作為定標品抗原母液備用；

定標品稀釋液即為定標品A組分，濃度為0.5ng/mL，2-8℃保存；

定標品B組分：用定標品稀釋液將游離三碘甲狀腺原氨酸fT3抗原母液稀釋至2ng/mL，2-8℃保存；

(5)得基于微流控芯片的游離三碘甲狀腺原氨酸fT3試劑盒。

2.根據權利要求1所述的基于微流控芯片的游離三碘甲狀腺原氨酸fT3試劑盒的制備方法，其特征在于，在所述步驟(2)中，所述熒光微球活化處理的方法為：稱取EDC使用Mes緩沖液配置成為10mg/mL的溶液，后使用Mes緩沖液進一步稀釋成為1mg/mL的溶液，量取1mg羧基熒光微球，微球固型物含量為10mg/mL，體積計算為100μL，置于EP管中，加入0.45mL Mes緩沖液稀釋，從1mg/mL的EDC活化劑溶液中取5uL迅速加入微球溶液中，渦旋混勻，于超聲清洗器中超聲10min，后置于滾軸混勻器上震蕩反應20min，總反應時間為30min。

3.根據權利要求1所述的基于微流控芯片的游離三碘甲狀腺原氨酸fT3試劑盒的制備方法，其特征在于，在所述步驟(3)中，所述封閉液含有2％BSA、0.5％Tween-20、10％海藻糖以及0.2％甘露醇。

4.根據權利要求3所述的基于微流控芯片的游離三碘甲狀腺原氨酸fT3試劑盒的制備方法，其特征在于，在所述步驟(3)中，封閉處理的方法為：向微流控芯片的反應腔室預先進行封閉處理，其中第二層芯片的背面反應腔室內需要添加6μL+6μL的封閉液進行封閉，第三層正面的反應腔室內，分別需要添加5μL+5μL+5μL的封閉液進行封閉。

5.根據權利要求1所述的基于微流控芯片的游離三碘甲狀腺原氨酸fT3試劑盒的制備方法，其特征在于，在所述步驟(3)中，所述微流控芯片為三片式結構，包括由上到下依次層疊的上層芯片、中層芯片以及下層芯片；上層芯片、中層芯片以及下層芯片兩兩之間均通過定位柱、定位孔配合連接的方式實現相互間的層疊。

6.一種基于微流控芯片的游離三碘甲狀腺原氨酸fT3試劑盒，包括有微流控芯片，其特征在于，還包括有定標品，所述定標品由A組分和B組分構成，其中，定標品稀釋液即為定標品A組分，濃度為0.5ng/mL；定標品B組分為用所述定標品稀釋液將游離三碘甲狀腺原氨酸fT3定標品抗原母液稀釋至2ng/mL；游離三碘甲狀腺原氨酸fT3抗原Triiodothyronine標記的熒光微球在所述微流控芯片內進行干燥處理；另一游離三碘甲狀腺原氨酸fT3鼠單抗Anti-h T3 10550包被在微流控芯片反應腔內。

7.一種基于微流控芯片檢測游離三碘甲狀腺原氨酸fT3的方法，其特征在于，采用權利要求1-5任一項所述的基于微流控芯片的游離三碘甲狀腺原氨酸fT3試劑盒的制備方法得到的試劑盒，包括以下步驟：

(1)移液器加樣，吸取100μL的樣本加入加樣孔內，將微流控芯片進入檢測儀器內，氣路裝置緩慢充氣，推動樣本往前移動，氣體由透氣口流出，液體在以PS為基材的微流控芯片內流入反應腔室內，樣本接觸反應艙室末端的導電橡膠，電容變化會觸動，關閉流道閥門，同時關閉氣路開關，停止加壓；

(2)儀器開啟超聲裝置，超聲混勻3-10分鐘，超聲探頭置于三層芯片底部，位于反應腔室的中間部分，避免直接超聲對芯片內的包被抗體產生影響，反應結束后氣體推動樣本進行向前移動，吹干加樣孔和流道樣本，清洗液路裝置啟動，進入反應腔室內，混勻1-3分鐘，進行清洗；加樣口處的氣體推動清洗液繼續進行移動，吹干反應腔室和流道液體；

(3)開啟激發光源，對免疫反應結合固定的熒光微球進行測定，儀器讀取芯片反應腔室的下面部分熒光強度，獲得數據后通過計算并給出相應結果報告。