[發(fā)明專利]一種高通量DNA多位點精確堿基突變方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810436798.2
• 申請日: 2018-05-09
• 公開（公告）號: CN108424907B
• 公開（公告）日: 2021-10-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 席建忠;朱丹;王干誠
• 申請（專利權(quán)）人: 北京大學(xué)
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢;張立娜

本發(fā)明公開了一種高通量DNA多位點精確堿基突變方法。本發(fā)明所提供的方法是基于重疊延伸PCR高通量對目標(biāo)基因片段多位點高效引入突變的方法；所用引物不是簡并引物，而是準(zhǔn)確設(shè)計目標(biāo)突變序列的突變引物；突變位點長度不限于單個氨基酸，可設(shè)計為連續(xù)1?5個氨基酸；引物非單條分開合成，而是由寡核苷酸合成儀在集成芯片上批量合成，引物種類量級可達(dá)10⁴?10⁵種類/批次；本發(fā)明所述突變方法可通過調(diào)節(jié)反應(yīng)條件在一定程度上實現(xiàn)對突變頻率的控制。本發(fā)明的突變建庫方法可獲得較高比例的有效突變體，建庫突變體陽性率(非同義氨基酸突變)可達(dá)～80％；本發(fā)明所建的突變體庫經(jīng)過后續(xù)高通量篩選成為獲得理想蛋白質(zhì)及核酸改造體的有力工具。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因操作技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種高通量DNA多位點精確堿基突變方法，具體是一種基于重疊延伸PCR，使用精確設(shè)計的寡核苷酸芯片高通量合成的突變引物文庫，向目標(biāo)基因片段多位點同時引入突變的方法。

背景技術(shù)

1967年Spiegelman等提出在體外分子水平定向進(jìn)化生物分子的思想，定向進(jìn)化技術(shù)是一種利用實驗室手段通過反復(fù)多次改造遺傳多樣性，結(jié)合高通量文庫篩選從而獲得理想性狀生物體的過程，現(xiàn)已成為蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域應(yīng)用最廣泛、最有效的技術(shù)之一。定向進(jìn)化屬于蛋白質(zhì)的非合理設(shè)計范疇，與理性突變方法相比，突變體的構(gòu)建無需受蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)信息和構(gòu)效關(guān)系的限制，而是在體外模擬自然進(jìn)化的過程(隨機突變和選擇)，在基因內(nèi)部引入大量變異，并通過篩選實現(xiàn)在較短時間內(nèi)定向選擇出所需性質(zhì)或功能的基因突變體。

早期的定向進(jìn)化技術(shù)的目標(biāo)多是單個蛋白，基本用于蛋白質(zhì)的研究和開發(fā)：通過隨機或定點引入突變，以獲得目的蛋白產(chǎn)量提高、蛋白催化活性提高或穩(wěn)定性增強等突變體以滿足生物催化及生物醫(yī)藥等領(lǐng)域的工業(yè)化需求。而近年來的趨勢則轉(zhuǎn)向于對整個代謝途徑甚至在基因組水平進(jìn)行改造，為有效合成有價值的生物產(chǎn)品構(gòu)建新型的全細(xì)胞催化體系。

易錯PCR是應(yīng)用最早、最成熟也是目前最常用的一項定向進(jìn)化技術(shù)。其原理是在體外擴增基因時適當(dāng)?shù)卣{(diào)整PCR實驗條件，使擴增過程層出現(xiàn)少量堿基錯配而引入突變的誘變方法。可調(diào)整的條件如使用低保真度的Taq酶，采用突變酶，調(diào)整反應(yīng)體系中4種dNTP比例，增加Mg²⁺濃度，加入Mn²⁺等。也可以組合多個條件以提高堿基錯配的機率。該方法的優(yōu)點是：易錯PCR操作簡單，無需額外合成特殊引物，且PCR過程中并未改變目標(biāo)片段擴增長度，突變頻率可在一定程度上通過調(diào)節(jié)反應(yīng)條件進(jìn)行相應(yīng)的控制，另外，迭代易錯PCR可使小的有益突變累積而獲得較為理想的突變體。不足之處是：(1)易錯PCR一般只會引入很小部分序列改變(以點突變?yōu)橹?，因而一般適用于較小的基因片段(＜2kb)。(2)引入突變的隨機性導(dǎo)致的大量同義突變、終止密碼子突變及讀碼框破壞等大量的冗余突變使得易錯PCR構(gòu)建的突變文庫有效率較低，有效突變體比例約占0.1-0.2％，增加了實驗成本，造成了下游篩選實驗的困難，難以獲得理想突變體。

1982年，加拿大著名科學(xué)家Smith等發(fā)明了寡聚核苷酸定點突變技術(shù)，為蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域的發(fā)展奠定了重要的基礎(chǔ)。定點突變作為一種最基本的理性設(shè)計方案至今仍被廣泛應(yīng)用于各種蛋白質(zhì)改造。然而定點突變技術(shù)面臨的最重要的難題是如何從其它19種天然氨基酸中選出可以達(dá)到改造蛋白目標(biāo)的最佳替換氨基酸。一系列研究表明，多點突變能獲得比起單點突變有更高概率獲得更理想的進(jìn)化子，然而多點突變是定點突變不易直接獲得的。針對這類問題，基于PCR的點飽和突變技術(shù)的開發(fā)由于其簡單快速及易操作性而受到了廣大研究者的青睞。

基于PCR的點飽和突變方法的基本原理是在靶點處設(shè)計簡并引物對目的基因進(jìn)行擴增以達(dá)到獲取突變子的目的。簡并引物的突變位點一般計為NNN或NNX(N代表4種核苷酸等比例混合物；X代表2種核苷酸等比例混合物(如G/C或G/T)，同一位點的各種核苷酸替換不存在偏好性。基于PCR的點飽和突變方法主要分為以下兩種：