[發明專利]一種高通量DNA多位點精確堿基突變方法

有效

• 申請號: 201810436798.2
• 申請日: 2018-05-09
• 公開（公告）號: CN108424907B
• 公開（公告）日: 2021-10-15
• 發明（設計）人: 席建忠;朱丹;王干誠
• 申請（專利權）人: 北京大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;張立娜

1.一種高通量對目標片段DNA多位點引入突變的方法，包括如下步驟：

(1)根據目標片段DNA的序列，針對每個預突變位點及其對應的預突變結果分別設計單鏈寡核苷酸片段；

所述單鏈寡核苷酸片段自5’端到3’端依次由上游接頭序列、內切酶M的正向識別序列、突變引物、所述內切酶M的反向識別序列和下游接頭序列組成；所述突變引物由對應于所述預突變位點的突變序列和位于所述目標片段DNA上所述預突變位點兩側的同源序列組成；

(2)合成步驟(1)所設計的單鏈寡核苷酸片段，獲得包含所述突變引物序列的混合ssDNA文庫；

(3)以步驟(2)所得的混合ssDNA文庫為模板，采用所述上游接頭序列和所述下游接頭序列作為引物對進行PCR擴增，然后采用所述內切酶M對所得PCR產物進行酶切處理，獲得短雙鏈突變引物文庫；

(4)利用所述目標片段DNA的全長上游引物和步驟(3)獲得的短雙鏈突變引物文庫對所述目標片段DNA進行首輪TouchDown PCR，擴增20-25個循環后得到一組產物，記為產物A；利用所述目標片段DNA的全長下游引物和步驟(3)獲得的短雙鏈突變引物文庫對所述目標片段DNA進行首輪TouchDown PCR，擴增20-25個循環后得到另一組產物，記為產物B；將所述產物A和所述產物B混合后繼續進行5-10個循環的第二輪TouchDown PCR，得到終產物；所述終產物中的DNA片段與所述目標片段DNA相比已被引入多位點突變；

步驟(1)中，還包括按照如下在所述突變引物內部排除所述內切酶M的識別序列的步驟：將存在所述內切酶M的識別序列的所述突變引物的序列在所述內切酶M的識別序列處進行同義氨基酸替換；

所述內切酶M為BspQI。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟(2)中，根據步驟(1)所設計的單鏈寡核苷酸片段的序列，利用DNA合成儀合成單鏈寡核苷酸片段并固定在用于制備芯片的固相載體上，合成結束后，將所述單鏈寡核苷酸片段從所述固相載體上脫離下來，獲得包含所述突變引物序列的混合ssDNA文庫。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟(1)中，每個所述預突變位點為1個氨基酸的點突變或者為2-5個連續的氨基酸突變。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟(1)中，所述突變引物中的所述突變序列為3-15nt，兩側的所述同源序列為15-21nt。

5.根據權利要求1-所述的方法，其特征在于：步驟(3)中進行的所述PCR擴增為兩輪PCR擴增；

第一輪PCR擴增：以所述混合ssDNA文庫為模板，采用所述上游接頭序列和所述下游接頭序列作為引物對，進行10個循環的PCR擴增，得到第一輪PCR擴增產物；

第二輪PCR擴增：將所述第一輪PCR擴增產物稀釋5-10倍后作為模板，采用所述上游接頭序列和所述下游接頭序列作為引物對，再進行10個循環的PCR擴增，得到第二輪PCR擴增產物。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟(4)中，所述全長上游引物和所述全長下游引物在各自的首輪TouchDown PCR反應體系中的終濃度均為0.5-1μM；所述短雙鏈突變引物文庫在首輪TouchDown PCR反應體系中的終濃度大于等于0.05-0.1μM。

7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟(4)中，所述TouchDown PCR的退火溫度由65℃以0.3℃/循環的速度遞減。

8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法在步驟(4)之后，還包括如下步驟(5)；

(5)將所述終產物組裝入高拷貝數質粒，轉化大腸桿菌感受態細胞，根據文庫大小進行突變體建庫，對構建好的文庫進行功能表型篩選；然后抽提質粒，擴增靶標片段并進行高通量測序分析。