[發(fā)明專利]一種番茄紅素高產(chǎn)菌株、其制備方法及應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810433054.5
• 申請(qǐng)日: 2018-05-08
• 公開（公告）號(hào): CN108588106B
• 公開（公告）日: 2022-03-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 郭美錦;韋炎龍;方宏清;洪琦;莊英萍;儲(chǔ)炬
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華東理工大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/70
• 分類號(hào): C12N15/70;C12N1/21;C12N15/52;C12N15/53;C12N15/54;C12N15/60;C12N15/61;C12P5/02;C12R1/19
• 代理公司: 上海專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 31100
• 代理人: 陳靜

本發(fā)明涉及一種番茄紅素高產(chǎn)菌株、其制備方法及應(yīng)用。本發(fā)明人通過基因工程的方法對(duì)大腸桿菌的異源代謝途徑進(jìn)行改造，將MVA下游途徑和番茄紅素途徑進(jìn)一步整合到大腸桿菌基因組不同位點(diǎn)，獲得了高產(chǎn)番茄紅素工程菌株。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于合成生物學(xué)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及高產(chǎn)番茄紅素的工程菌株、其制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)

番茄紅素是一種天然抗氧化劑，是一種C₄₀萜類化合物，天然來(lái)源于植物或微生物中。它作為人體必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有提高人體免疫力、抗衰老、抗氧化等功效，是一種暢銷的保健品。研究表明，番茄紅素對(duì)癌癥還具有一定的預(yù)防效果。作為對(duì)人體無(wú)害的天然紅色色素，番茄紅素還廣泛應(yīng)用于食品，化妝品行業(yè)。

目前，番茄紅素產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)主要通過以下三種方法：直接提取法，化學(xué)合成法和微生物合成法。直接提取法是指利用乙酸乙酯，丙酮或正己烷等有機(jī)溶劑將番茄紅素從新鮮番茄或脫水番茄中提取出來(lái)。但是番茄紅素在植物中的含量低，這大大提高了制備番茄紅素產(chǎn)品的成本。利用化學(xué)合成法生產(chǎn)番茄紅素，具有成本低，得率高的優(yōu)點(diǎn)。但是，由于副產(chǎn)物多，番茄紅素制品中含有結(jié)構(gòu)復(fù)雜、結(jié)構(gòu)未知、無(wú)法脫離的殘留物。因此，利用化學(xué)合成發(fā)生產(chǎn)的番茄紅素產(chǎn)品不適合作為食品或保健品來(lái)長(zhǎng)期服用。

利用微生物合成法生產(chǎn)番茄紅素，具有成本低、產(chǎn)量高、工藝簡(jiǎn)單、易于放大等優(yōu)點(diǎn)，并且不受季節(jié)、氣候條件的限制。目前，微生物合成法生產(chǎn)番茄紅素主要利用三孢布拉氏霉菌。發(fā)酵五天后產(chǎn)量為0.93g(Tereshina，V.M.等；Microbiology，2010，79(1):34-39.)。但是，三孢不拉氏霉菌生長(zhǎng)緩慢，發(fā)酵周期長(zhǎng)，這大大增加了生產(chǎn)番茄紅素的成本。而模式微生物大腸桿菌，具有生長(zhǎng)快，遺傳背景清晰，分子生物學(xué)操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，是理想的宿主。但是，大腸桿菌自身不產(chǎn)番茄紅素，需要額外導(dǎo)入表達(dá)番茄紅素的異源代謝途徑。2001年，Kim和Keasling以大腸桿菌為宿主，通過強(qiáng)化內(nèi)源MEP途徑增加番茄紅素前體的生產(chǎn)(Kim，S.W.等，Biotechnology and Bioengineering，2001，72(4):408-415.)。他們利用質(zhì)粒系統(tǒng)同時(shí)過表達(dá)來(lái)源于草生歐文氏桿菌(E.herbicola)的牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸(GGPP)合成酶基因(crtE)、crtB、crtI以及大腸桿菌內(nèi)源MEP途徑的的1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶基因(dxs)，培養(yǎng)54h后，番茄紅素發(fā)酵水平達(dá)到22mg/L(Kim，S.W.等，Biotechnology and Bioengineering，2001，72(4):408-415.)。2003年，Martin等人率先利用大腸桿菌過表達(dá)法尼呢烯焦磷酸(FPP)合成酶基因(ispA)，異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶基因(idi)，紫穗槐二烯合成酶基因(ADS)以及來(lái)源于釀酒酵母的MVA途徑基因(atoB，HMGS，刪減型HMGR，ERG12，ERG8和MVD1)，成功獲得抗瘧藥前體——紫穗槐-4，11-二烯(Martin，V.J.J.等，Nature Biotechnology，2003，21(7):796-802.)。此后，開啟了利用大腸桿菌異源MVA途徑提高萜類化合物前體的研究。利用大腸桿菌異源MVA代謝途徑的優(yōu)點(diǎn)是：1)MVA途徑相比于MEP途徑，發(fā)現(xiàn)更早，研究更透徹。2)可以避免宿主的內(nèi)源代謝調(diào)節(jié)機(jī)制控制。2006年，Yoon等人將MVA途徑分為上游途徑和下游途徑(Yoon，S.H.等，2006，94(6):1025-1032.)。MVA上游途徑是從乙酰輔酶A到甲羥戊酸，下游途徑是從甲羥戊酸到IPP和DMAPP。他們以大腸桿菌為宿主，構(gòu)建雙質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)分別裝載MVA下游途徑基因和番茄紅素合成途徑基因，搖瓶培養(yǎng)72h后番茄紅素發(fā)酵水平為102mg/L(Yoon，S.H.等，Biotechnology andBioengineering，2006，94(6):1025-1032.)。但是，該重組大腸桿菌不含MVA上游途徑基因，須以額外添加的甲羥戊酸為前體。Zhu等人在此基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)獲得改良工程菌株，其無(wú)需額外添加甲羥戊酸(Zhu，F(xiàn).等，Process Biochemistry，2015，50(3)，341-346.)，可以直接以宿主內(nèi)源乙酰輔酶A為前體合成番茄紅素，搖瓶培養(yǎng)72h后番茄紅素產(chǎn)量為92.3mg/L。但是，該工程菌株存在以下不足：1)三質(zhì)粒系統(tǒng)導(dǎo)致宿主延至期過長(zhǎng)；2)質(zhì)粒存在不穩(wěn)定性，包括分離不穩(wěn)定性、結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性和等位基因隔離(Tyo，K.E.J.等，NatureBiotechnology，2009，27(8):760-765.)；3)培養(yǎng)基中需添加抗生素維持質(zhì)粒存在。本發(fā)明人在之前的研究中，將MVA上游途徑表達(dá)元件ES、MVA下游途徑表達(dá)元件S1和番茄紅素合成途徑表達(dá)元件GC的整到了大腸桿菌基因組上，構(gòu)建了整合型菌株DH411(Wei，Y.等，Bioresource Technology，2018，250:382-389)。但是，番茄紅素得率極低，只有0.66mg/gDCW，后續(xù)依賴質(zhì)粒系統(tǒng)過表達(dá)S1和GC才能實(shí)現(xiàn)番茄紅素高產(chǎn)，番茄紅素產(chǎn)量最高產(chǎn)量為68.5mg/L。