[發(fā)明專利]檢測萵苣花葉病毒的成套試劑

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201810430265.3
• 申請日: 2018-05-08
• 公開（公告）號: CN108624715A
• 公開（公告）日: 2018-10-09
• 發(fā)明（設計）人: 張永江;向均
• 申請（專利權）人: 中國檢驗檢疫科學研究院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 北京紀凱知識產(chǎn)權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;魏少偉

本發(fā)明公開了檢測萵苣花葉病毒的成套試劑。本發(fā)明公開的檢測萵苣花葉病毒的成套試劑由名稱為P1的引物對和名稱為A1的DNA組成；P1由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成；A1為含有所述P1的識別序列的DNA。實驗證明，本發(fā)明的檢測萵苣花葉病毒的成套試劑可在確保目標序列高效擴增的同時有效規(guī)避篩查假陰性的發(fā)生，且特異性好、靈敏、準確、簡便和快速，對進出境相關植物及產(chǎn)品檢驗檢疫具有指導意義。

技術領域

本發(fā)明涉及生物技術領域中的檢測萵苣花葉病毒的成套試劑。

背景技術

萵苣(Lactuca sativa L.)是菊科萵苣屬植物，是常見的蔬菜之一。高品質(zhì)的萵苣中含有豐富的無機鹽、維生素、煙酸以及微量元素，萵苣中的無機鹽有助于調(diào)節(jié)體內(nèi)鹽的平衡，煙酸可幫助糖尿病人改善糖的代謝功能，維生素和微量元素可維持人正常生命活動，然而萵苣花葉病毒病的發(fā)生可嚴重影響萵苣的品質(zhì)，導致萵苣的營養(yǎng)價值降低。

萵苣花葉病毒病由萵苣花葉病毒(Lettuce mosic virus，LMV)侵染引起，在自然條件下萵苣感染萵苣花葉病毒后，葉片邊緣出現(xiàn)不規(guī)則和皺縮癥狀，繼而出現(xiàn)淡綠色或淡黃色斑駁或者花葉癥狀；病害發(fā)生嚴重時，可導致萵苣嚴重矮化，結籽率下降，嚴重影響萵苣產(chǎn)量和質(zhì)量。LMV是馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)重要成員之一，其核酸為正義單鏈RNA(+ssRNA)，病毒粒體為線狀。LMV的自然寄主包括萵苣(Lactucasativa L.)、菠菜(Spinacia oleracea L.)及豌豆(Pisum sativum L.)等多種植物，LMV可通過萵苣種子傳遞給下一代，并通過蚜蟲迅速傳播，可導致病害大面積流行。

常用的LMV檢測方法主要有生物學測定、血清學測定、病毒粒子特性觀察以及分子檢測。生物學以及血清學檢測方法的檢測靈敏度低、耗時長且工作量大；病毒粒子特性觀察需使用的電子顯微鏡，而電子顯微鏡的高成本及低普及率限制了該技術的發(fā)展；目前使用最多的是分子檢測技術，主要包括RT-PCR、熒光定量PCR和數(shù)字PCR等，這些分子檢測技術都需要經(jīng)過預變性、變性、退火及延伸等步驟，每個步驟都需要熱循環(huán)儀來保證其對溫度的特殊要求且整個過程耗時長。因此解決分子檢測技術對溫度的限制及耗時長的問題對于病毒檢測具有重要意義。

重組酶聚合酶擴增技術(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)是近年來興起的一種常溫核酸擴增技術。RPA技術模仿體內(nèi)核酸復制機制，在能結合單鏈核酸的重組酶uvsX、單鏈結合蛋白(SSB)Gp32及鏈置換DNA聚合酶Bsu的作用下進行核酸分子的擴增。重組酶uvsX能在常溫下解開雙鏈DNA，反應開始進行時，重組酶uvsX與單鏈引物DNA結合，形成核酸蛋白復合體，復合體識別與引物序列互補的模板DNA并形成D環(huán)狀，與此同時，SSB與被置換的單鏈結合使單鏈穩(wěn)定。然后，重組酶uvsX被降解，鏈置換DNA聚合酶Bsu與核酸蛋白復合體的3′端開始鏈的延伸，新鏈與原始鏈互補配對完成擴增。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術問題是如何檢測萵苣花葉病毒。

為解決上述技術問題，本發(fā)明首先提供了檢測或輔助檢測萵苣花葉病毒的成套試劑，所述成套試劑由名稱為P1的引物對和名稱為A1的DNA組成；

所述P1由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成；

所述A1為含有所述P1的識別序列的DNA。

所述A1可為a1)或a2)：

a1)含有序列表中序列3所示DNA片段的DNA；

a2)序列表中序列3所示的DNA片段。