[發明專利]一種柑橘黃龍病菌的巢式PCR檢測方法

在審

• 申請號: 201810429977.3
• 申請日: 2018-05-08
• 公開（公告）號: CN108611430A
• 公開（公告）日: 2018-10-02
• 發明（設計）人: 洪艷云;易圖永;羅永陽;戴良英;譚小平
• 申請（專利權）人: 湖南農業大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/04;C12R1/01
• 代理公司: 北京知本村知識產權代理事務所 11039
• 代理人: 劉江良

本發明公開了一種柑橘黃龍病菌的巢式PCR精準檢測方法，該方法利用柑橘黃龍病菌外膜蛋白基因(OMP)在不同柑橘黃龍病菌中高度保守性原理,設計兩對特異性引物F3/B3和F1/B1，應用這兩對引物對待測樣品進行PCR擴增,擴增產物經克隆測序獲得長度為447bp的基因片段，經NCBI在線比對該片段能100％覆蓋柑橘黃龍病菌外膜蛋白合成酶基因，且一致性為100%。本發明檢測方法所使用的這對引物有別于其它檢測技術，可以用于快速精準鑒定柑橘黃龍病。

技術領域

本發明涉及一種普通柑橘黃龍病菌的檢測方法，尤指檢測柑橘黃龍病菌亞洲種的巢式PCR的檢測方法。

背景技術

柑橘黃龍病是一種發生在柑橘韌皮部，對柑橘產業造成毀滅性傷害的世界性柑橘病害，該病一旦發病無藥可治，所以被稱之為“柑橘癌癥”。它是由α－變形菌門（α-Proteobacteria）中不能培養的革蘭氏陰性菌CadidatusLiberibacter引發的，它們共有三個亞種，分別是CadidatusLiberibacter asiaticus（縮寫為CLas），CadidatusLiberibacter africanus（縮寫為CLaf）CadidatusLiberibacter americanus（縮寫為CLam），分別引發亞洲柑橘黃龍病，非洲柑橘黃龍病及美洲柑橘黃龍病。柑橘黃龍病沒有特異性病癥，而且至今還沒有研發出能根治柑橘黃龍病特效藥，因此對該病的防控主要依賴早期診斷性檢測。

關于柑橘黃龍病菌的檢測技術，此前一直根據此病菌的16S rDNA基因采用普通PCR和熒光定量PCR。該兩種方法都存在缺陷，普通PCR由于靈敏度過低，經常漏檢，而熒光定量PCR又由于靈敏度過高造成檢測出大量的假陽性（Kunta, M., J.V. da Gra?a, N.Malik, E. S. Louzada, and M. Sétamou. 2014. Quantitative distribution ofCandidatus Liberibacter asiaticus in the aerial parts of the HLB-infectedcitrus trees in Texas. HortScience 49: 65-68.）。

因此有必要建立一種精準的柑橘黃龍病檢測技術。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是：針對上述現有技術的不足，提供一種柑橘黃龍病菌快速而精準的PCR檢測方法。

為了解決上述技術問題，本發明所采用的技術方案是：一種柑橘黃龍病菌亞洲種的巢式PCR檢測方法，其特點是：根據柑橘黃龍病菌外膜蛋白基因（OMP）在同一亞種內高度保守性原理設計兩對特異性引物（F3/B3和F1/B1）對待測樣品進行巢式PCR擴增，最后電泳鑒定；特異性引物為：

第一對引物F3/B3:正向引物：5’-GGTTATGCTGCCGTTAAAGTGTC-3’

反向引物: 5’-AACCAGCCCTTTCAGGAACAAG-3’

第二對引物F1/B1:正向引物：5’-TCTGAGGGTGAGCGTAAAACAACTG-3’

反向引物: 5’-TTGGGAAATAGAATGGCTGCTGAAT-3’。

進一步地，所述的柑橘黃龍病菌的巢式PCR精準檢測方法，具體如下：