[發(fā)明專利]一種環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)假陽性污染問題的有效改良方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810419228.2
• 申請日: 2018-05-04
• 公開（公告）號: CN108315216B
• 公開（公告）日: 2021-08-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李偉昊
• 申請（專利權(quán)）人: 邯鄲市疾病預(yù)防控制中心
• 主分類號: C12M1/00
• 分類號: C12M1/00;C12M1/36;C12Q1/6848
• 代理公司: 北京盛凡智榮知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11616
• 代理人: 戴翔

1.一種環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)假陽性污染問題的有效改良方法，包括此方法使用的設(shè)備等溫擴增裝置本體（1），其特征在于：所述等溫擴增裝置本體（1）上設(shè)有上蓋（2）和底座（3），上蓋（2）和底座（3）鉸接連接，所述底座（3）內(nèi)固定設(shè)有至少兩個放置架（4），所述放置架（4）內(nèi)設(shè)有可更換的透明反應(yīng)管（5），所述透明反應(yīng)管（5）開口處設(shè)有水平的支撐條（6），所述支撐條（6）中心處設(shè)有擠壓凸起（7），所述上蓋（2）頂部設(shè)有氣缸腔（8），所述氣缸腔（8）內(nèi)頂部設(shè)有氣缸（9），所述氣缸（9）的活塞桿連接設(shè)有蒸汽管架（10），所述蒸汽管架（10）貫通上蓋（2）蓋壁處設(shè)有蒸汽噴頭（11），所述蒸汽管架（10）連通蒸汽噴頭（11），所述蒸汽噴頭（11）端部設(shè)有單向閥腔體（12），所述蒸汽管架（10）一端連通設(shè)有蒸汽進口（13），另一端設(shè)有泄壓閥（14），所述底座（3）底部中心處設(shè)有排水閥（15），排水閥（15）連通等溫擴增裝置本體（1）內(nèi)腔，所述等溫擴增裝置本體（1）內(nèi)設(shè)有恒溫控制器（17），所述恒溫控制器（17）、氣缸（9）和排水閥（15）均電性連接控制器（16）；

根據(jù)上述裝置的結(jié)構(gòu)原理，所述使用方法包括如下步驟：

1）擴增前準備：打開上蓋（2），在透明反應(yīng)管（5）內(nèi)滴入22-28微升環(huán)介導(dǎo)等溫擴增體系的試劑，同時加入0.4-0.7毫克瓊脂糖粉，然后在單向閥腔體（12）內(nèi)注入1-2毫升的1000×SYBR Green I染料，環(huán)介導(dǎo)等溫擴增體系試劑各組分體積分別為：8000U/mL的BstDNA聚合酶0.75-1.25微升，含Mg2+2mM的10×Buffer 2.25-2.75微升，100mM的Mg2+ 0.25-0.75微升且終濃度4mM，10mM的dNTP0.75-1.25微升且終濃度0.4 mM，內(nèi)引物 10mM FIP、BIP各3.75-4.25微升且終濃度1.6mM，外引物10mM的 F3、B3各0.25-0.75微升且終濃度0.2mM，環(huán)引物10mM 的LF、LB各0.75-1.25微升且終濃度0.4mM，滅菌水7.75-8.25微升，模板0.75-1.25微升；

2）等溫擴增：調(diào)節(jié)恒溫控制器（17），使得等溫擴增裝置本體（1）內(nèi)的溫度為60-65℃，擴增55-65分鐘；

3）改良處理：擴增結(jié)束后，調(diào)節(jié)恒溫控制器（17），使得等溫擴增裝置本體（1）內(nèi)的溫度為90-100℃，高溫變性，然后通水蒸汽，蒸汽噴頭（11）釋放水蒸氣，反應(yīng)形成的氣溶膠被水蒸汽吸附；

4）檢測環(huán)節(jié)：靜置1-2分鐘，待瓊脂糖凝固；控制單向閥腔體（12）的出液為1微升/滴，氣缸（9）動作，使得單向閥腔體（12）出液1-2滴，反應(yīng)1-2分鐘后，控制打開排水閥（15）排廢水，然后打開上蓋（2），觀察反應(yīng)后的顏色變化；肉眼觀察的判斷依據(jù)為：橙色為陰性結(jié)果，綠色為陽性結(jié)果。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)假陽性污染問題的有效改良方法，其特征在于：所述蒸汽噴頭（11）上設(shè)有若干蒸汽噴孔。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)假陽性污染問題的有效改良方法，其特征在于：所述排水閥（15）連通位置為底座（3）內(nèi)底平面最低位置處。