[發明專利]一種環介導等溫擴增技術假陽性污染問題的有效改良方法

有效

• 申請號: 201810419228.2
• 申請日: 2018-05-04
• 公開（公告）號: CN108315216B
• 公開（公告）日: 2021-08-03
• 發明（設計）人: 李偉昊
• 申請（專利權）人: 邯鄲市疾病預防控制中心
• 主分類號: C12M1/00
• 分類號: C12M1/00;C12M1/36;C12Q1/6848
• 代理公司: 北京盛凡智榮知識產權代理有限公司 11616
• 代理人: 戴翔

本發明涉及為解決上述技術問題，本發明提供的技術方案為：一種環介導等溫擴增技術假陽性污染問題的有效改良方法，包括此方法使用的設備等溫擴增裝置本體，根據上述裝置的使用方法，所述方法包括如下步驟：擴增前準備：打開上蓋，在反應管內滴入22?28微升環介導等溫擴增體系的試劑，同時加入0.4?0.7毫克瓊脂糖粉，然后在單向閥腔體內注入1?2毫升的1000×SYBR Green I染料。本發明要解決的技術問題是解決LAMP假陽性污染問題，提供一種環介導等溫擴增技術假陽性污染問題的有效改良方法，操作簡單，步驟合理，有效的消除LAMP假陽性污染的問題。

技術領域

本發明涉及假陽性污染改良技術領域，具體是指一種環介導等溫擴增技術假陽性污染問題的有效改良方法。

背景技術

環介導等溫擴增技術(Loop-mediated isothermal amplification LAMP)是日本學者Notomi等2000年創建的。LAMP反應需要4條或6條引物共同作用，及具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶完成擴增。反應在60℃-65℃恒溫擴增,不需要熱循環。該反應有特異性高、靈敏度高、反應時間短、設備要求簡單等優點。同時由于LAMP產物量巨大，實驗結束后開蓋形成氣溶膠污染實驗室，造成結果假陽性的問題十分嚴重。因此，研究LAMP假陽性污染問題的改良方法具有重要的意義。

目前常用的防止假陽性污染問題的方法主要有以下幾種：方法一，使用特定的PCR管，管中有一個固定的小隔板將管分成兩個區域，一個加反應液一個加DNA染料，這種方法增加了加液次數，不適用于大批量檢測；方法二，將染料包埋在石蠟中，反應結束后高溫石蠟融化，釋放染料，該方法制備包埋染料，增加檢測準備時間。針對這樣的情況，有必要研制一種新方法，來解決LAMP假陽性污染問題。

發明內容

本發明要解決的技術問題是解決LAMP假陽性污染問題，提供一種環介導等溫擴增技術假陽性污染問題的有效改良方法，操作簡單，步驟合理，有效的消除LAMP假陽性污染的問題。

為解決上述技術問題，本發明提供的技術方案為：一種環介導等溫擴增技術假陽性污染問題的有效改良方法，包括此方法使用的設備等溫擴增裝置本體，所述等溫擴增裝置本體上設有上蓋和底座，上蓋和底座鉸接連接，所述底座內固定設有至少兩個放置架，所述放置架內設有可更換的透明反應管，所述透明反應管開口處設有水平的支撐條，所述支撐條中心處設有擠壓凸起，所述上蓋頂部設有氣缸腔，所述氣缸腔內頂部設有氣缸，所述氣缸的活塞桿連接設有蒸汽管架，所述蒸汽管架貫通上蓋蓋壁處設有蒸汽噴頭，所述蒸汽管架連通蒸汽噴頭，所述蒸汽噴頭端部設有單向閥腔體，所述蒸汽管架一端連通設有蒸汽進口，另一端設有泄壓閥，所述底座底部中心處設有排水閥，排水閥連通等溫擴增裝置本體內腔，所述等溫擴增裝置本體內設有恒溫控制器，所述恒溫控制器、氣缸和排水閥均電性連接控制器；

根據上述裝置的結構原理，所述使用方法包括如下步驟：

1)擴增前準備：打開上蓋，在透明反應管內滴入22-28微升環介導等溫擴增體系的試劑，同時加入0.4-0.7毫克瓊脂糖粉，然后在單向閥腔體內注入1-2毫升的1000×SYBRGreen I染料，環介導等溫擴增體系試劑各組分體積分別為：BstDNA聚合酶(8000U/mL)0.75-1.25微升，10×Buffer 2.25-2.75微升(含Mg2+2mM)，Mg2+(100mM)0.25-0.75微升(終濃度4mM)，dNTP(10mM)0.75-1.25微升(終濃度0.4mM)，內引物10mM FIP、BIP各3.75-4.25微升(終濃度1.6mM)，外引物10mM F3、B3各0.25-0.75微升(終濃度0.2mM)，環引物10mM LF、LB各0.75-1.25微升(終濃度0.4mM)，滅菌水7.75-8.25微升，模板0.75-1.25微升；

2)等溫擴增：調節恒溫控制器，使得等溫擴增裝置本體內的溫度為60-65℃，擴增55-65分鐘；