[發明專利]基于核酸適配體-量子點結合蘇云金芽孢桿菌孢子的熒光測定法

在審

• 申請號: 201810415673.1
• 申請日: 2018-05-03
• 公開（公告）號: CN108663343A
• 公開（公告）日: 2018-10-16
• 發明（設計）人: 劉軍安
• 申請（專利權）人: 武漢世格美檢測技術有限公司
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 武漢藍寶石專利代理事務所(特殊普通合伙) 42242
• 代理人: 廉海濤

本發明公開了一種基于核酸適配體?量子點結合蘇云金芽孢桿菌孢子的熒光測定法，包括Cry1Ab蛋白即Bt蛋白的、核酸適配體?量子點混合物的制備，將核酸適配體?量子點與芽孢桿菌孢子結合。本發明通過核酸適配體?量子點與芽孢桿菌孢子結合的方法對轉基因水稻中Bt蛋白結果進行檢測，檢測結果客觀、易判定，可對轉基因產品的含量進行定量分析，同時檢測速度快，檢測靈敏度高。

技術領域

本發明屬于轉基因成分的檢測技術領域，具體涉及一種基于核酸適配體-量子點結合蘇云金芽孢桿菌孢子的熒光測定法。

背景技術

轉基因生物的安全評價是轉基因生物及其產品市場化和商品化的前提，在安全評價中轉基因成分的檢測是一項重要內容。

我國對轉基因水稻的研究處于世界領先水平，其中，研發的一些抗病、抗蟲轉基因水稻品系已經申請生產種植用生物安全證書，但由于它們的轉基因生物安全問題等一些原因，至今尚未有品系批準商業化生產應用。鑒于轉基因水稻技術的成熟以及其產品市場化的趨勢，因此建立一種快速、簡便的檢測Bt蛋白的方法，具有必要性和緊迫性。

目前對于轉基因成分的檢測可從外源基因的核酸和蛋白質兩個水平進行。核酸水平的檢測，主要針對轉入的外源基因的核苷酸序列并根據外源基因與內源基因的同源性設計檢測方法，主要采用的方法是PCR擴增，即依據轉入外源基因的啟動子、目的基因、終止子及表達(重組)載體信息，設計特異性引物，進行聚合酶鏈式反應，依據產物的有無或多少判斷是否為轉基因產品。PCR反應具有高靈敏度、高特異性、高效性的特點，是轉基因產品初篩階段的主要檢測方法。

蛋白檢水平的檢測，主要是基于抗原和抗體相互作用的免疫學方法，針對轉基因植物及其產品中外源目的基因表達的特異性蛋白進行定性和定量檢測。1971年瑞典的Engvall等人分別以纖維素和聚丙乙烯試管作為固相載體吸附抗原/抗體，建立了酶聯免疫吸附法(Enzyme Linked ImmunosrbentAssay，簡稱ELISA方法)。1974年Voller等人改用聚苯乙烯微量反應板作為固相免疫吸附載體，使ELISA方法得以推廣應用，使得用于抗原定位的酶標記抗體技術發展成為液體標本中微量物質的測定方法，并逐漸成為抗原抗體檢測中最為常用的一種方法。它將酶標記物同抗原抗體復合物的免疫反應與酶的催化放大作用相結合，既保持了酶催化反應的敏感性，又保持了抗原抗體反應的特異性，因而極大的提高了靈敏度。同時它又是一種非均相免疫分析方法，即在反應的每一步都有洗滌過程，從而除去了未反應物和干擾物質。由于ELISA方法具有靈敏度高、特異性強、操作簡便、檢測迅速和非放射性以及可以批量測定等諸多優點，使得ELISA方法得到了越來越廣泛的應用。

但是隨著檢測靈敏度的要求越來越高，通過轉基因成分的檢測和蛋白質兩個水平的檢測已經完全不能滿足目前發展的需要。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的缺陷，提供一種適用于轉基因水稻中Bt的高靈敏度快速檢測方法，利用核酸適配體-量子點結合蘇云金芽孢桿菌孢子實現快速的檢測。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：

一種基于核酸適配體-量子點結合蘇云金芽孢桿菌孢子的熒光測定法，包括以下步驟：

(1)核酸適配體-量子點的制備：

1.1、將13.9μL 10mM SMCC(琥珀酰亞胺-4-(N-馬來酰亞胺)環已烷-1-1羥酸酯)添加到125μL量子點中并在室溫下放置一小時以激活量子點；

1.2、在300μL 1mg/ml一倍工作濃度的PBS溶液中制備5′巰基修飾的寡核苷酸，向溶液中加入6.1μl 1m的二硫蘇糖醇(DTT)并在室溫下放置30分鐘以縮減適配體；

1.3、激活量子點的溶液以及縮減適配體的溶液分別通過一個nap-5脫鹽柱(Sephadex G-25脫鹽柱)，每個溶液收集500μl；