[發明專利]基于核酸適配體-量子點結合蘇云金芽孢桿菌孢子的熒光測定法

在審

• 申請號: 201810415673.1
• 申請日: 2018-05-03
• 公開（公告）號: CN108663343A
• 公開（公告）日: 2018-10-16
• 發明（設計）人: 劉軍安
• 申請（專利權）人: 武漢世格美檢測技術有限公司
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 武漢藍寶石專利代理事務所(特殊普通合伙) 42242
• 代理人: 廉海濤

1.一種基于核酸適配體-量子點結合蘇云金芽孢桿菌孢子的熒光測定法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)核酸適配體-量子點的制備：

1.1、將13.9μL 10mM SMCC(琥珀酰亞胺-4-(N-馬來酰亞胺)環已烷-1-1羥酸酯)添加到125μL量子點中并在室溫下放置一小時以激活量子點；

1.2、在300μL 1mg/ml一倍工作濃度的PBS溶液中制備5′巰基修飾的寡核苷酸，向溶液中加入6.1μl 1m的二硫蘇糖醇(DTT)并在室溫下放置30分鐘以縮減適配體；

1.3、激活量子點的溶液以及縮減適配體的溶液分別通過一個nap-5脫鹽柱(SephadexG-25脫鹽柱)，每個溶液收集500μl；

1.4、然后將量子點和縮減適體在室溫下反應一個小時。將10.1μLβ-巰基乙醇(100μM的最終濃度)加入到混合物中來淬火共軛反應，并在室溫下放置30分鐘，通過柱純化，共收集到250μL核酸適配體-量子點；

1.5、將10μl核酸適配體-量子點溶解在1ml反滲透純凈水中。運用一個uv-2100分光光度計來衡量在260nm時的吸光度；

1.6、核酸適配體-量子點的實際濃度由與最初的核酸適配體濃度(1.08mg/ml)進行比較來決定；

(2)將核酸適配體-量子點與芽孢桿菌孢子結合：

2.1、將30μL核酸適配體-量子點放置在一個試管中并用600μL PBS進行稀釋；

2.2、用同樣的程序進行一系列重復的反應：核酸適配體-量子點無孢子，非結合的量子點與Bt孢子，核酸適配體-量子點與純化的Bt孢子結合，核酸適配體-量子點與BG孢子結合；

2.3、之前收集的孢子，用PBS將13mm微孔膜過濾器(PVDF，親水性，0.45μm)洗兩次，孢子暴露于核酸適配體-量子點或非結合的量子點中的任何一個后在過濾器中收集并用1ml一倍工作濃度的PBS溶液洗滌三次，洗過的孢子在1ml PBS中收集。

2.根據權利要求1所述的基于核酸適配體-量子點結合蘇云金芽孢桿菌孢子的熒光測定法，其特征在于：在所述步驟1.4中，反應產物使用0.5ml集中器集中，然后添加到200柱Superdex脫鹽柱并用PBS進行洗脫。

3.根據權利要求1所述的基于核酸適配體-量子點結合蘇云金芽孢桿菌孢子的熒光測定法，其特征在于：所述步驟1.6中，核酸適配體共軛量子點的百分比被確定為98％。

4.根據權利要求1所述的超聲波乳化裝置，其特征在于：在所述步驟(2.2)中，將PBS稀釋的100μL核酸適配體-量子點分別加入900μL 107,106,105,104,103CFU的Bt孢子中。混合物用VSM 3旋渦混合器短暫的渦旋(速度8)并放置在室溫下反應20min。