[發(fā)明專利]一種篩選標(biāo)記自主控制剔除轉(zhuǎn)基因載體及其在玉米無標(biāo)記轉(zhuǎn)基因育種中的應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810414159.6
• 申請日: 2018-05-03
• 公開（公告）號(hào): CN108588114A
• 公開（公告）日: 2018-09-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張方東;杜鄧襄
• 申請（專利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/82
• 分類號(hào): C12N15/82;C12N15/65;A01H5/00;A01H6/46
• 代理公司: 北京高沃律師事務(wù)所 11569
• 代理人: 劉奇

本發(fā)明提供了一種篩選標(biāo)記自主控制剔除轉(zhuǎn)基因載體及其在玉米無標(biāo)記轉(zhuǎn)基因育種中的應(yīng)用，屬于玉米分子育種技術(shù)領(lǐng)域，所述載體以pEGAD載體為骨架載體，使用EGFP和IPT基因的融合基因替換bar基因作為篩選標(biāo)記；所述篩選標(biāo)記的表達(dá)框整合在Cre/lox位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)中。所述應(yīng)用包括以下步驟：將所述的載體轉(zhuǎn)入玉米胚性愈傷組織中，獲得有綠色熒光表達(dá)的玉米胚性愈傷組織；熱激處理后，分化生根培養(yǎng)無綠色熒光表達(dá)的玉米胚性愈傷組織獲得轉(zhuǎn)基因植株。所述載體提高了篩選效率，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了轉(zhuǎn)基因篩選標(biāo)記的剔除，為大范圍開展無標(biāo)記的玉米轉(zhuǎn)基因工作提供了理論和應(yīng)用基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于玉米分子育種技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種篩選標(biāo)記自主控制剔除轉(zhuǎn)基因載體及其在玉米無標(biāo)記轉(zhuǎn)基因育種中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

玉米(Zea mays L.)是世界上最重要的農(nóng)作物之一，作為世界上眾多地區(qū)的糧食作物和大部分地區(qū)的主要飼料作物，在全世界廣泛種植。同時(shí)玉米也是重要的工業(yè)原料，被廣泛用于發(fā)酵工業(yè)、酒精制造和提供生物能源。玉米的育種改良和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)是影響我國糧食安全的重要因素。近幾十年，隨著誘變育種技術(shù)、轉(zhuǎn)基因技術(shù)、雙單倍體技術(shù)和分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)等育種新技術(shù)在商業(yè)育種中的逐步完善和推廣應(yīng)用，玉米育種逐漸形成了常規(guī)育種向分子育種、經(jīng)驗(yàn)育種向精確育種過渡的趨勢。

自從世界上首例轉(zhuǎn)基因植物(煙草)問世，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育作物新品種已經(jīng)成為重要的育種手段。理論上講，轉(zhuǎn)基因技術(shù)是通過目標(biāo)基因的交流實(shí)現(xiàn)的，與傳統(tǒng)育種技術(shù)沒有本質(zhì)區(qū)別，而且在技術(shù)上，轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)改良的遺傳信息更清楚、更明確、更具體，選擇效率高。轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)成功克服了遠(yuǎn)緣雜交不親和的困難，將優(yōu)良的基因?qū)氲绞荏w物種中，實(shí)現(xiàn)了育種性狀的定向改變，有效地打破了物種間生殖隔離的障礙，豐富了材料的多樣性。在實(shí)際生產(chǎn)中，實(shí)現(xiàn)了減少玉米產(chǎn)量損失和農(nóng)藥化肥使用量的目標(biāo)，帶來了巨大的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)和生態(tài)效益。

隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，篩選標(biāo)記的優(yōu)化一直是發(fā)展高效的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的一個(gè)重要組成部分。有效的將轉(zhuǎn)化細(xì)胞從未轉(zhuǎn)化細(xì)胞中分離篩選出來，是轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)的最關(guān)鍵的部分之一。選擇標(biāo)記的存在提高了轉(zhuǎn)基因的效率，但是一旦轉(zhuǎn)基因操作完成，使用的篩選標(biāo)記在轉(zhuǎn)基因材料中往往沒有任何應(yīng)用價(jià)值。而這些篩選標(biāo)記持續(xù)穩(wěn)定地表達(dá)不利于對(duì)該材料進(jìn)行更多基因的轉(zhuǎn)化 (后期可以選用的篩選標(biāo)記太少)，同時(shí)也會(huì)引起公眾對(duì)篩選標(biāo)記安全性和環(huán)境保護(hù)方面的擔(dān)憂。一些人認(rèn)為轉(zhuǎn)基因植株中存在一些具有抗生素抗性的標(biāo)記基因，可能在動(dòng)物的腸道中轉(zhuǎn)移給微生物，產(chǎn)生難以用抗生素抵抗的“超級(jí)微生物”，從而影響抗生素的治療效果；更多的研究則表明轉(zhuǎn)基因植物的基因具有通過基因漂移轉(zhuǎn)移到近緣的非轉(zhuǎn)基因植物的可能，引起近緣物種獲得潛在的選擇優(yōu)勢，產(chǎn)生抗蟲、抗病或抗除草劑的所謂“超級(jí)雜草”。為了在成功進(jìn)行轉(zhuǎn)基因篩選的同時(shí)避免或者解決篩選標(biāo)記帶來了負(fù)面影響，選用新型的相對(duì)安全的篩選標(biāo)記和篩選標(biāo)記的剔除等技術(shù)策略，為安全轉(zhuǎn)基因應(yīng)用提供了有效途徑。

現(xiàn)在研究中使用的安全篩選標(biāo)記有糖代謝相關(guān)基因、抗逆相關(guān)基因和形態(tài)學(xué)相關(guān)基因。這些篩選標(biāo)記的使用，降低了轉(zhuǎn)基因植株的潛在風(fēng)險(xiǎn)。隨著人們對(duì)轉(zhuǎn)基因安全意識(shí)的提高，開發(fā)新型更安全的篩選標(biāo)記以及篩選標(biāo)記的剔除仍是植物轉(zhuǎn)基因研究的重要方向。篩選標(biāo)記的剔除也是安全轉(zhuǎn)基因應(yīng)用的一個(gè)重要發(fā)展方向。目前，已開發(fā)的轉(zhuǎn)基因標(biāo)記基因刪除技術(shù)有共轉(zhuǎn)化法、表達(dá)盒轉(zhuǎn)化法、位點(diǎn)特異重組法以及基于位點(diǎn)特異性重組的基因疊加技術(shù)、轉(zhuǎn)座子法和染色體同源重組法等。

位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)由重組酶和重組位點(diǎn)兩部分組成，在重組酶的催化和參與下通過小范圍內(nèi)同源序列的聯(lián)會(huì)產(chǎn)生重組，剔除重組位點(diǎn)間的篩選標(biāo)記獲得無標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因植株。Onouchi等利用此方法成功獲得了篩選標(biāo)記基因剔除而只含有目的基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株。