[發明專利]一種篩選標記自主控制剔除轉基因載體及其在玉米無標記轉基因育種中的應用在審
| 申請號： | 201810414159.6 | 申請日： | 2018-05-03 |
| 公開（公告）號： | CN108588114A | 公開（公告）日： | 2018-09-28 |
| 發明（設計）人： | 張方東;杜鄧襄 | 申請（專利權）人： | 華中農業大學 |
| 主分類號： | C12N15/82 | 分類號： | C12N15/82;C12N15/65;A01H5/00;A01H6/46 |
| 代理公司： | 北京高沃律師事務所 11569 | 代理人： | 劉奇 |
| 地址： | 430000 湖北省武漢市洪山區獅子山*** | 國省代碼： | 湖北;42 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 篩選標記 愈傷組織 無標記 玉米胚 剔除 轉基因育種 轉基因載體 綠色熒光 自主控制 位點特異性重組系統 應用 理論和應用 玉米轉基因 轉基因植株 骨架載體 熱激處理 融合基因 生根培養 玉米分子 育種技術 玉米 表達框 轉基因 整合 替換 篩選 轉入 分化 | ||
1.一種篩選標記自主控制剔除轉基因載體，其特征在于，以pEGAD載體為骨架載體，使用綠色熒光蛋白基因EGFP和異戊烯基轉移酶IPT基因的融合基因替換所述pEGAD載體上的bar基因作為篩選標記；所述篩選標記的表達框整合在Cre/lox位點特異性重組系統中，所述Cre/lox位點特異性重組系統連接熱激誘導型啟動子，由熱激誘導型啟動子激活重組酶驅動位點特異性重組產生。
2.根據權利要求1所述的載體，其特征在于，所述載體的靶基因區域插入花青素合成基因Rsc。
3.根據權利要求1或2所述的載體，其特征在于，包括具有如SEQ ID NO.1所示的堿基序列。
4.權利要求1～3任意一項所述的載體在玉米無標記轉基因育種中的應用，包括以下步驟：
1)通過農桿菌介導轉化法將權利要求1～3任意一項所述的載體轉入玉米胚性愈傷組織中，恢復培養、篩選獲得有綠色熒光表達的玉米胚性愈傷組織；
2)熱激處理所述有綠色熒光表達的玉米胚性愈傷組織后，恢復培養，篩選獲得無綠色熒光表達的玉米胚性愈傷組織；
3)將所述無綠色熒光表達的玉米胚性愈傷組織進行分化、生根培養，篩選獲得正常生根且無叢生芽的轉基因植株。
5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，步驟1)和2)中所述恢復培養為暗培養；所述恢復培養的時間獨立為28～32d；所述恢復培養的溫度獨立為26～30℃。
6.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，步驟1)或2)中所述篩選獨立的在藍光燈或熒光顯微鏡460～495nm激發光下進行。
7.根據權利要求4或6所述的應用，其特征在于，步驟1)中所述篩選包括1～4輪。
8.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，步驟2)中所述熱激處理的溫度為40～44℃。
9.根據權利要求4或8所述的應用，其特征在于，步驟2)中所述熱激處理的時間為1.5～2.5h。
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