[發明專利]單核細胞增生李斯特氏菌標準樣品及其制備方法

在審

• 申請號: 201810411606.2
• 申請日: 2018-05-02
• 公開（公告）號: CN108865922A
• 公開（公告）日: 2018-11-23
• 發明（設計）人: 唐靜;賈俊濤;黃小華;吳振興;方佩佩;林超;張曉良;趙麗青
• 申請（專利權）人: 山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N1/04;C12R1/445;C12R1/01
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.單核細胞增生李斯特氏菌標準樣品，其特征是：包括目標菌和背景菌群，所述目標菌為單核細胞增生李斯特氏菌，所述背景菌群由英諾克李斯特氏菌，綿羊李斯特氏菌，金黃色葡萄球菌組成。

2.根據權利要求1所述的標準樣品，其特征是：所述樣品以豬肉、丙酮酸鈉、維生素C和無菌生理鹽水為基質，其中丙酮酸鈉的濃度為500 mg/kg、維生素C的濃度為500mg/kg。

3.根據權利要求2所述的標準樣品，其特征是，基質中還加入干燥保護劑，濃度為500mg/kg；

所述的干燥保護劑成分為：脫脂乳粉，谷氨酸鈉、羧甲基纖維素鈉，瓜爾膠、海藻酸鈉。

4.根據權利要求1所述的標準樣品，其特征是：脫脂乳粉，谷氨酸鈉、羧甲基纖維素鈉，瓜爾膠、海藻酸鈉的重量比為：5:1-2:1-3:2-5:1-3。

5.根據權利要求1所述的標準樣品，其特征是：所述樣品中目標菌的目標濃度為10²~10³CFU/g，背景菌群的目標濃度為10³~10⁴CFU/g。

6.制備權利要求1所述的菌標準樣品的方法，其特征是：包括樣品基質的選擇及制備、添加菌株的選擇、菌株復蘇傳代、增菌、對目標菌的低溫刺激、菌懸液配制、樣品分裝、真空冷凍干燥和包裝、儲存等，具體過程為：

（1）樣品基質的選擇及制備

選購豬的脊椎骨內側的條狀嫩肉，即豬的里脊肉，要求其色澤紅潤，肉質透明，質地緊密，富有彈性，手按后能夠很快復原，并除去連在肉上的筋和膜，只保留質嫩無筋的瘦肉；

將豬肉混合攪勻，每5 kg攪碎豬肉中加1 kg丙酮酸鈉和1 kg維生素C溶液，丙酮酸鈉的濃度為500 mg/kg、維生素C的濃度為500 mg/kg，混勻制成肉漿；

（2）添加菌株的選擇

根據權利要求1選擇單核細胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogens）ATCC13932，英諾克李斯特氏菌（Listeriainnocua）ATCC33090，綿羊李斯特氏菌（Listeria ivanuii）ATCC BAA-139，金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC29213；

（3）菌株復蘇傳代

將標準菌株接種到營養瓊脂斜面培養基上，在36±1℃下使其復蘇和生長，并對復蘇的菌株進行鑒定；

（4）增菌

將鑒定后符合要求的標準菌株接種到營養肉湯中，在36±1℃下進行培養，目標菌培養至對數生長期末，背景菌群培養至穩定期，備用；

（5）低溫刺激

將對數生長期的目標菌放到4±1℃下繼續培養，培養至穩定期，備用；

（6）菌懸液的配制

將上述過程（4）和（5）得到的菌液，用無菌生理鹽水進行梯度稀釋，稀釋到目標菌的目標濃度為10⁵~10⁶CFU/mL，背景菌群的目標濃度為10⁶~10⁷CFU/mL，將目標菌和背景菌群的稀釋液1:1混合均勻，得到備用混合菌液；

（7）樣品分裝

向步驟（1）得到的豬肉肉漿中加入步驟（6）得到的混合菌液7 mL，加入干燥保護劑，進一步混合，使用攪拌器不斷攪拌，確保菌液和肉糜混合均勻，將混合均勻的肉糜分裝到樣品瓶中，加上瓶塞，但要留有空隙，不要蓋實，每瓶重量為1.5 g；

（8）真空冷凍干燥和包裝

將裝有肉糜的樣品瓶開蓋放入凍干機中，真空冷凍干燥48~50 h，當樣品凍干程序結束后，直接在凍干機內進行壓塞，關閉機器，進行放氣，取出樣品時樣品瓶內為真空狀態；

（9）儲存

取出的樣品再加蓋金屬蓋進行密封，放置在-18℃條件下避光保存，從全部樣品中隨機挑選樣品進行均勻性和穩定性實驗。