[發(fā)明專利]一種高產(chǎn)聚γ-谷氨酸的地衣芽胞桿菌的制備方法及應用有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201810410909.2 | 申請日： | 2018-05-02 |
| 公開（公告）號： | CN108611308B | 公開（公告）日： | 2021-06-01 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 陳守文;王世依;蔡冬波;何鵬輝;陳耀中;莫非;馬昕 | 申請（專利權(quán)）人： | 湖北大學 |
| 主分類號： | C12N1/21 | 分類號： | C12N1/21;C12N15/75;C12P13/02;C12P13/14;C12R1/10 |
| 代理公司： | 武漢宇晨專利事務所 42001 | 代理人： | 龔瑩瑩 |
| 地址： | 430000 湖北*** | 國省代碼： | 湖北;42 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 高產(chǎn) 谷氨酸 地衣 桿菌 制備 方法 應用 | ||
本發(fā)明涉及生物技術(shù)和發(fā)酵領(lǐng)域，公開了一種高產(chǎn)聚γ?谷氨酸的地衣芽胞桿菌的制備方法及應用，本發(fā)明以質(zhì)粒T2(2)?Ori為基礎(chǔ)，通過構(gòu)建檸檬酸轉(zhuǎn)運蛋白基因
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及生物技術(shù)和發(fā)酵領(lǐng)域，具體涉及一種高產(chǎn)聚γ-谷氨酸的地衣芽胞桿菌的制備方法及應用。
背景技術(shù)
聚γ-谷氨酸(Poly glutamic acid,γ-PGA)是一種由D-谷氨酸、L-谷氨酸或D，L-谷氨酸組成的陰離子型谷氨酸聚合物，相對分子量在10KD-3000KD。根據(jù)谷氨酸單體間酰胺鍵連接方式可分為聚α-谷氨酸和聚γ-谷氨酸，γ-PGA分子鏈存在著游離羧基，分子與分子之間作用的氫鍵由游離羧基提供，因此γ-PGA有著諸多特點：易溶于水；良好的保水能力；吸附金屬離子；主鏈由肽鍵構(gòu)成，在酶降解下可以降解成短肽或單體氨基酸，因此具有可生物降解性；耐熱，耐紫外線。γ-PGA還可以作為藥物載體、組織工程材料、化妝品添加劑和食品添加劑等。
作為三羧酸循環(huán)重要的中間代謝物—檸檬酸，是γ-PGA合成過程當中不可或缺的物質(zhì)，同時也是一種良好的金屬離子的螯合劑。檸檬酸在菌體代謝過程中會有部分合成，但合成量較低，不足以滿足目標產(chǎn)物的合成需求。
本申請發(fā)現(xiàn)，通過敲除地衣芽胞桿菌中檸檬酸轉(zhuǎn)運蛋白基因cimH，進而提高了檸檬酸利用效率和γ-PGA的合成量。目前對于γ-PGA高產(chǎn)策略一般集中在途徑改造和轉(zhuǎn)錄調(diào)控，本發(fā)明首次通過敲除地衣芽胞桿菌中檸檬酸轉(zhuǎn)運蛋白基因來提高γ-PGA產(chǎn)量，為γ-PGA高產(chǎn)提供一種新的策略。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供一種高產(chǎn)聚γ-谷氨酸的地衣芽胞桿菌的制備方法，該方法通過在地衣芽胞桿菌的基因組內(nèi)敲除cimH基因，缺失檸檬酸/蘋果酸轉(zhuǎn)運蛋白，提高了γ-PG A產(chǎn)量。
本發(fā)明的另一個目的在于提供了一種高產(chǎn)聚γ-谷氨酸的地衣芽胞桿菌的制備方法的應用。利用本發(fā)明的方法，可用于工業(yè)化制備聚γ-谷氨酸。
為了達到上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)措施：
一種高產(chǎn)聚γ-谷氨酸的地衣芽胞桿菌(Bacillus licheniformis)的制備方法，通過將地衣芽胞桿菌中的cimH基因敲除后得到。
以上所述的方法中，優(yōu)選的，所述的地衣芽胞桿菌(Bacillus licheniformis)為地衣芽胞桿菌(Bacillus licheniformis)WX-02；
以上所述的方法中，具體的，包括下述步驟：
(1)以地衣芽胞桿菌WX-02的基因組DNA為模板，PCR擴增出cimH基因的上游同源臂和cimH基因的下游同源臂；
(2)通過重疊延伸PCR將cimH基因的上游同源臂和cimH基因的下游同源臂連接到一起，構(gòu)成目的基因片段，該目的基因片段的排列順序為：cimH基因的上游同源臂-cimH基因的下游同源臂；
(3)采用SacI和XbaI限制性內(nèi)切酶對目的基因片段進行雙酶切得到酶切基因片段，同時，采用SacI和XbaI限制性內(nèi)切酶對質(zhì)粒T2(2)-ori進行雙酶切得到線性質(zhì)粒片段；
(4)將步驟(2)得到的酶切目的片段和步驟(3)得到的線性質(zhì)粒片段經(jīng)T4-DNA連接酶進行連接，經(jīng)過氯化鈣轉(zhuǎn)化法將酶連的產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α中，以卡那青霉素為抗性篩選標記，并經(jīng)過菌落PCR，得到陽性轉(zhuǎn)化子，經(jīng)過測序得到敲除質(zhì)粒T2(2)-△cimH；
該專利技術(shù)資料僅供研究查看技術(shù)是否侵權(quán)等信息，商用須獲得專利權(quán)人授權(quán)。該專利全部權(quán)利屬于湖北大學，未經(jīng)湖北大學許可，擅自商用是侵權(quán)行為。如果您想購買此專利、獲得商業(yè)授權(quán)和技術(shù)合作，請聯(lián)系【客服】
本文鏈接：http://www.szxzyx.cn/pat/books/201810410909.2/2.html，轉(zhuǎn)載請聲明來源鉆瓜專利網(wǎng)。
