[發明專利]一種高產聚γ-谷氨酸的地衣芽胞桿菌的制備方法及應用

有效

• 申請號: 201810410909.2
• 申請日: 2018-05-02
• 公開（公告）號: CN108611308B
• 公開（公告）日: 2021-06-01
• 發明（設計）人: 陳守文;王世依;蔡冬波;何鵬輝;陳耀中;莫非;馬昕
• 申請（專利權）人: 湖北大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/75;C12P13/02;C12P13/14;C12R1/10
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 龔瑩瑩

1.一種高產γ-PGA的地衣芽胞桿菌（Bacillus licheniformis）的制備方法，通過將地衣芽胞桿菌WX-02中的cimH基因敲除后得到，所述的cimH基因為SEQ ID NO.1所示。

2.一種高產γ-PGA的地衣芽胞桿菌（Bacillus licheniformis）的制備方法，包括下述步驟：

（1）以地衣芽胞桿菌WX-02的基因組DNA為模板，PCR擴增出cimH基因的上游同源臂和cimH基因的下游同源臂；

（2）通過重疊延伸PCR將cimH基因的上游同源臂和cimH基因的下游同源臂連接到一起，構成目的基因片段，該目的基因片段的排列順序為：cimH基因的上游同源臂-cimH基因的下游同源臂；

（3）采用SacI和XbaI限制性內切酶對目的基因片段進行雙酶切得到酶切基因片段，同時，采用SacI和XbaI限制性內切酶對質粒 T2(2)-ori進行雙酶切得到線性質粒片段；

（4）將步驟（2）得到的酶切目的片段和步驟（3）得到的線性質粒片段經 T4-DNA連接酶進行連接，經過氯化鈣轉化法將酶連的產物轉入大腸桿菌DH5α中，以卡那青霉素為抗性篩選標記，并經過菌落PCR，得到陽性轉化子，經過測序得到敲除質粒T2(2)-△cimH；

（5）將敲除質粒T2(2)-△cimH轉入地衣芽胞桿菌WX-02中，以卡那青霉素抗性作為篩選標記，篩選得到陽性轉化子；

（6）將陽性轉化子在45℃條件下轉接培養數次后，進行菌落PCR檢測，得到cimH基因的上游同源臂或cimH基因的下游同源臂與地衣芽胞桿菌WX-02基因組DNA產生單交換的陽性單交換結合子菌株；

（7）挑選cimH基因的上游同源臂與地衣芽胞桿菌WX-02基因組DNA產生單交換的陽性單交換結合子菌株與cimH基因的下游同源臂與地衣芽胞桿菌WX-02基因組DNA產生單交換的陽性單交換結合子菌株混合接種于37℃、不含有卡那青霉素的培養基中經過數次轉接培養，PCR法篩選得到缺失了cimH基因的地衣芽胞桿菌WX-02△cimH；

所述cimH基因的核苷酸序列為SEQ ID NO.1所示。

3.利用權利要求1所述的方法制備得到的地衣芽胞桿菌在生產聚-γ-谷氨酸中的應用。