[發(fā)明專利]一種用于多重聚合酶鏈反應(yīng)檢測的液滴

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• 申請日: 2018-04-28
• 公開（公告）號: CN108676861A
• 公開（公告）日: 2018-10-19
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王策;白鵬利
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686
• 代理公司: 北京遠(yuǎn)大卓悅知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11369
• 代理人: 韓飛

本發(fā)明公開了一種用于多重聚合酶鏈反應(yīng)檢測的液滴，包括一般內(nèi)容物、表面和特征物；所述一般內(nèi)容物分布于液滴內(nèi)部，為聚合酶鏈反應(yīng)提供反應(yīng)條件；表面包裹于液滴外部，形成穩(wěn)定的液滴界面；特征物位于液滴的內(nèi)部，是生物反應(yīng)相容的固體材料，在固體材料表面固載有模板分子鏈，該模板分子鏈可通過聚合酶鏈反應(yīng)被放大信號，用于實現(xiàn)核酸分子的定性檢測或者定量檢測；本案中，每個微滴類似于單重PCR的一個管，每個微滴的擴(kuò)增反應(yīng)是相對獨立的，能有效改善傳統(tǒng)多重PCR反應(yīng)體系較大而存在相互干擾的問題，是一種非常有效的多重核酸擴(kuò)增方法。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子檢測領(lǐng)域，具體涉及一種用于多重聚合酶鏈反應(yīng)檢測的液滴。

背景技術(shù)

聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)技術(shù)是目前應(yīng)用最廣泛的核酸檢測技術(shù)，其主要優(yōu)勢在于簡便、穩(wěn)定，而且應(yīng)用基礎(chǔ)好。多重PCR的原理是在反應(yīng)體系內(nèi)同時加入多對特異性引物，同時擴(kuò)增出多條目的DNA片段，由于各引物的擴(kuò)增片段的大小存在明顯差異，根據(jù)產(chǎn)物的片段大小或利用分子雜交以實現(xiàn)多個微生物的同時檢測。自1988年首次提出多重PCR這個概念，經(jīng)過多年的發(fā)展，多重PCR技術(shù)逐漸成熟。

但PCR技術(shù)的主要局限在于多重基因檢測可涵蓋的靶基因數(shù)量有限，要實現(xiàn)多重檢測往往需要多管來實現(xiàn)。雖然目前有些方法能夠?qū)崿F(xiàn)多重檢測，但仍然存在一些問題。現(xiàn)有的多重檢測技術(shù)都是先經(jīng)過多重PCR擴(kuò)增，這種多靶標(biāo)的擴(kuò)增有以下問題：特異性和靈敏度不理想；某一特定片段有限擴(kuò)增；由于多重PCR反應(yīng)體系中同時存在幾對引物，使得形成引物二聚體的幾率增大；如果非特異性產(chǎn)物優(yōu)先擴(kuò)增，將會大量消耗反應(yīng)底物，降低特異性擴(kuò)增效率。針對上述問題，許多學(xué)者開發(fā)了多種新型的多重PCR技術(shù)，如雙啟動寡核苷酸引物、多重連接依賴式探針擴(kuò)增、特異性目標(biāo)延伸、靶序列富集多重PCR、巢式PCR等，這些技術(shù)在某些方面使多重基因檢測有一定的提高，但還是存在很多問題。目前對多重PCR的檢測手段主要有毛細(xì)管電泳(或凝膠電泳)、液相芯片、質(zhì)譜等方式，不管以何種方式檢測，前期的多重擴(kuò)增質(zhì)量會直接影響檢測結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足之處，本發(fā)明的目的在于提供一種用于多重聚合酶鏈反應(yīng)檢測的液滴，以降低多重PCR反應(yīng)中多種探針的非特異性雜交反應(yīng)，同時避免競爭反應(yīng)所導(dǎo)致的底物不足問題。

本案提供了一種用于多重聚合酶鏈反應(yīng)檢測的液滴，包括一般內(nèi)容物、表面和特征物；

其中，所述一般內(nèi)容物分布于液滴內(nèi)部，包括聚合酶鏈反應(yīng)引物、脫氧核糖核苷三磷酸、酶、生物探針、金屬離子，為聚合酶鏈反應(yīng)提供反應(yīng)條件；

所述表面包裹于液滴外部，形成穩(wěn)定的液滴界面，該表面可由同種或不同種特定成分形成，不易破裂，便于擴(kuò)增、拾取、轉(zhuǎn)移等后續(xù)操作；

所述特征物位于液滴的內(nèi)部，是生物反應(yīng)相容的固體材料；所述固體材料表面固載有模板分子鏈；所述模板分子鏈通過聚合酶鏈反應(yīng)被放大信號，用于定性檢測或者定量檢測。

優(yōu)選的是，所述的液滴，其特征在于，所述液滴的體積為常規(guī)聚合酶鏈反應(yīng)反應(yīng)體系的1/1000-1/10000000，典型液滴的體積為0.01納升-100納升。

優(yōu)選的是，所述特征物為編碼微粒，每個液滴中最多含有一個編碼微粒，每個編碼微粒與單一種屬的模板分子鏈偶聯(lián)，形成映射關(guān)系；其中，所述模板分子因堿基序列不同為相異種屬；所述每個編碼微粒具有各自的編碼特征。

優(yōu)選的是，所述液滴用于同一反應(yīng)體系中多重聚合酶鏈反應(yīng)的反應(yīng)物檢測，通過編碼微粒的編碼特征來確定模板分子鏈的種屬；通過在模板分子鏈上發(fā)生的PCR反應(yīng)使信號被放大而易于檢測，并定性其為陽性(結(jié)合了目標(biāo)模板分子鏈而發(fā)生了特異性PCR)或陰性(未結(jié)合目標(biāo)模板分子鏈而沒有發(fā)生特異性PCR反應(yīng))，以及通過分子探針的熒光等特性定量分析分子鏈的數(shù)量。