[發明專利]細胞分析法檢測低密度脂蛋白受體相關蛋白4抗體

在審

• 申請號: 201810403072.9
• 申請日: 2018-04-28
• 公開（公告）號: CN108845134A
• 公開（公告）日: 2018-11-20
• 發明（設計）人: 楚蘭;李媛;張藝凡;賀電;蔡剛
• 申請（專利權）人: 楚蘭;李媛;張藝凡;賀電;蔡剛
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 北京酷愛智慧知識產權代理有限公司 11514
• 代理人: 安娜

本發明涉及一種細胞分析法檢測低密度脂蛋白受體相關蛋白4抗體，包括步驟：采用pReceiver?M98質粒，構建出用EGFP標記LRP4的完整開放閱讀框架的真核表達載體，得到重組質粒；將重組質粒轉染培養好的HEK293T細胞，得到攜帶重組質粒的HEK293T細胞；將攜帶重組質粒的表達細胞依次進行培養、細胞固定、封閉和孵育，然后采用熒光顯微鏡進行觀察，檢測出低密度脂蛋白受體相關蛋白。本發明提供的采用細胞分析法檢測低密度脂蛋白受體相關蛋白4抗體，因抗原抗體一一對應，特異性幾乎達到100％，為重癥肌無力患者的診治提供了必要的實驗依據，對重癥肌無力患者的診治提供了新的方向，具有重要的意義。

技術領域

本發明涉及醫學技術領域，具體涉及一種細胞分析法檢測低密度脂蛋白受體相關蛋白4抗體。

背景技術

自1672年重癥肌無力(MG)被發現以來，其發病機制通常被認為主要與乙酰膽堿受體抗體(AChR-Ab)介導的體液免疫息息相關，但是隨著眾多科學家對MG免疫學發病機制的深入研究，現在普遍認為多種肌肉抗原(例如：MuSK-Ab)、補體系統、抗原特異性T淋巴細胞、細胞因子以及胸腺等均對MG的發病起到了重要作用。

對MG患者進行血清學抗體檢測及其免疫學致病機制的研究已經逐漸成為世界范圍內該病討論的熱點問題，約有85％的MG患者血清中可檢測出AChR-Ab；余下的MG患者約有70％血清中可以檢測出肌肉特異性酪氨酸激酶抗體(MuSK-Ab)。實驗證實，在貴州高海拔多民族聚集地區所收集的共計116例MG患者中，AChR-Ab單陽性率為50.0％。其中女性占大多數；分型以眼肌型及輕度全身型為主。56名未檢測出AChR-Ab抗體的MG患者中僅有6人(10.7％)檢測出MuSK-Ab陽性。這個比例遠低于歐美人種的數據，但與國內相關資料接近。

雖然大部分的MG患者可檢測出AChR-Ab和MuSK-Ab，但仍然有一部分病人(10％左右)體內無法檢測出上述兩種抗體，他們體內是否存在未知的致病性抗體尚不明確，這種類型重癥肌無力患者的出現給臨床診治帶來了一定的困難。2011年，Higuchi等首次在dSN-MG患者血清中檢測出了LRP4-Ab，故認為新發現的LRP4是dSN-MG患者體內自身抗體的靶目標。這些抗體屬于IgG1，它可能通過抑制神經元釋放的Agrin與胞外LRP4的結合、介導NMJ傳遞障礙而致病。同時，LRP4-Ab激活補體系統導致體內發生自身抗原抗體免疫反應，Agrin-LRP4-MuSK信號通路受到破壞而致病。Higuchi的實驗檢測發現300例dSN-MG患者中共有9例LRP4-Ab陽性(3％)。Pevzner等共檢測13例dSN-MG，7例LRP4-Ab呈明顯陽性(陽性率約為53.8％)；Tzartos的研究表明，約有9.2％的dSN-MG患者血清中檢測出LRP4-Ab；Georgios等檢測并分析了3例同人種的LRP4-Ab陽性患者的人口學特點、臨床表現及療效。這些發現均表明LRP4-Ab可能是dSN-MG患者新的診斷標志物。故中國人中該抗體的陽性率為多少，以及檢測方法是我們研究的目標。

發明內容

針對現有技術中的缺陷，本發明目的在于提供一種細胞分析法檢測低密度脂蛋白受體相關蛋白4抗體，以提高檢測方法的特異性，為重癥肌無力患者的診治提供了必要的實驗依據，對重癥肌無力患者的診治提供了新的方向，具有重要的意義。

為實現上述目的，本發明提供的技術方案為：

本發明提供了一種檢測低密度脂蛋白受體相關蛋白的方法，包括步驟：構建重組質粒；將重組質粒轉染培養好的HEK293T細胞，得到攜帶重組質粒的HEK293T細胞；將攜帶重組質粒的表達細胞(HEK293T細胞)依次進行培養、細胞固定、封閉和孵育，然后采用熒光顯微鏡進行觀察，檢測出低密度脂蛋白受體相關蛋白。