[發明專利]一種用于區分八種豬胸膜肺炎放線桿菌血清型的復合PCR分型試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 201810402911.5
• 申請日: 2018-04-28
• 公開（公告）號: CN108676900B
• 公開（公告）日: 2020-04-21
• 發明（設計）人: 袁芳艷;田永祥;劉澤文;劉威;周丹娜;楊克禮;段正贏;郭銳;高婷
• 申請（專利權）人: 湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 湖北武漢永嘉專利代理有限公司 42102
• 代理人: 崔友明;徐曉琴

本發明屬于生物技術技術領域，具體涉及一種用于區分八種豬胸膜肺炎放線桿菌血清型的復合PCR分型試劑盒及其應用。所述復合PCR分型試劑盒包括：PCR試管、PCR混合酶、5對特異性引物、陽性對照、陰性對照和ddH₂O，所述5對特異性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1～10所示。所述復合PCR分型試劑盒用于區分1型、3型、4型、5型、6型、10型、12型和14型八種豬胸膜肺炎放線桿菌血清型具有很高的準確性，特異性好，靈敏度達pg級；進行鑒別的樣品來源包括分離的菌種資源或動物組織，可以直接將組織洗滌液或單菌落、菌液經沸水裂解后作為模板，省去了細菌基因組提取的繁瑣，大大節約了時間、人力和成本。

技術領域

本發明屬于生物技術技術領域，具體涉及一種用于區分八種豬胸膜肺炎放線桿菌血清型 的復合PCR分型試劑盒及其應用。

背景技術

豬傳染性胸膜肺炎是引起豬呼吸系統的一種嚴重的接觸性傳染病，以急性出血性纖維素 性胸膜肺炎和慢性纖維素壞死性胸膜肺炎為特性，廣泛存在于世界上養豬地區，特別是養豬 業發達的國家和地區，給養豬業造成巨大的經濟損失。

豬傳染性胸膜肺炎可感染各年齡階段的豬只，以6周-6月齡的豬較為多發；且具有較 明顯的季節性，多在4月～5月和9月～11月發生。病豬和帶菌豬是本病的主要傳染源，多呈 繼發或并發其他疾病，導致臨床癥狀加重、死亡率升高。自1957年首次報道以來，隨著國家與國家之間的頻繁引種，豬傳染性胸膜肺炎逐漸擴散開來，造成世界范圍內的廣泛流行。我國八十年代開始有該病的報道，九十年代在廣東、青島等地區爆發流行，造成了巨大的經濟損失。近年來，隨著集約化豬場的快速發展，豬傳染性胸膜肺炎感染發病率也日益增高，已經在我國大部分地區流行開來，并有愈發愈烈的趨勢。

豬傳染性胸膜肺炎的主要病原為胸膜肺炎放線桿菌(APP)。加膜多糖和菌體脂多糖不同， 可分為15血清型。根據煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的依賴性可把15血清型分為兩個生物 型。生長依賴NAD的菌株為生物Ⅰ型，包括血清型1～12型和15型；生長不依賴NAD的菌株為 生物Ⅱ型，包括血清型13和14。其中血清型1和5型又可分為a和b兩個亞型。此外，還有一些 根據現有分型方法不能定型的血清型。

不同血清型間的致病力不完全相同，普遍認為，生物I型APP的致病性要強于生物II型， 而且各血清型間交叉保護力比較弱。APP在不同國家的分別存在差異，各國的優勢血清型也 不相同。隨著不同國家及地區之間豬只的流通加劇，APP也變得日益復雜，同一地區，甚至 同一豬場存在多個血清型同時存在的狀況。在中國，目前已發現并分離到血清型有1、2、3、 4、5、7、8和15等，主要流行血清型有1、3、5和7型。

豬胸膜肺炎放線桿菌的分型方法主要分為血清學方法和基因分型方法。血清學分型方法 主要有補體結合、間接血凝、乳膠凝集、瓊脂擴散、ELISA。但因為操作繁瑣、周期長、或 敏感性低、特異性差等不能滿足臨床的需求。而且目前豬場多為混合感染，因此迫切希望一 種高度特異、敏感和簡便的方法來高通量、快速分型方法。基因分型方法主要為PCR分型方 法，復合PCR技術以其特異、快速、敏感、適于大量樣品檢測等優點，成為當今細菌病檢測 和診斷中最具應用價值的方法。

發明內容

本發明針對現有技術的不足，目的在于提供一種用于區分八種豬胸膜肺炎放線桿菌血清 型的復合PCR分型試劑盒及其應用。

為實現上述發明目的，本發明采用的技術方案為：

一種用于區分1型、3型、4型、5型、6型、10型、12型和14型八種豬胸膜肺炎放線 桿菌血清型的PCR引物對，包括5對特異性引物，所述特異性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1～10所示。

一種用于區分1型、3型、4型、5型、6型、10型、12型和14型八種豬胸膜肺炎放線 桿菌血清型的復合PCR分型試劑盒，包括：PCR試管、PCR混合酶、5對特異性引物、陽性 對照、陰性對照和ddH₂O。