[發明專利]一種用于區分八種豬胸膜肺炎放線桿菌血清型的復合PCR分型試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 201810402911.5
• 申請日: 2018-04-28
• 公開（公告）號: CN108676900B
• 公開（公告）日: 2020-04-21
• 發明（設計）人: 袁芳艷;田永祥;劉澤文;劉威;周丹娜;楊克禮;段正贏;郭銳;高婷
• 申請（專利權）人: 湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 湖北武漢永嘉專利代理有限公司 42102
• 代理人: 崔友明;徐曉琴

1.一種用于區分1型、3型、4型、5型、6型、10型、12型和14型八種豬胸膜肺炎放線桿菌血清型的復合PCR分型試劑盒，其特征在于，包括：PCR試管、PCR混合酶、5對特異性引物、陽性對照、陰性對照和ddH₂O，所述5對特異性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1~10所示；所述PCR混合酶包含Taq酶5U/μL、10×ExTaq Buffer、dNTP Mixture 25mM和MgCl₂ 25mM。

2.根據權利要求1所述的用于區分1型、3型、4型、5型、6型、10型、12型和14型八種豬胸膜肺炎放線桿菌血清型的復合PCR分型試劑盒，其特征在于，所述陽性對照為豬胸膜肺炎放線桿菌血清型標準菌株DNA混合物。

3.根據權利要求2所述的用于區分1型、3型、4型、5型、6型、10型、12型和14型八種豬胸膜肺炎放線桿菌血清型的復合PCR分型試劑盒，其特征在于，所述豬胸膜肺炎放線桿菌血清型標準菌株DNA混合物為標準1型4074株、標準3型S1421株、標準4型M62株、標準5a型MIDG2216、標準6型FemΦ株、標準10型D13039株、標準12型1096株和標準14型MIDG2226的DNA混合物。

4.根據權利要求1所述的用于區分1型、3型、4型、5型、6型、10型、12型和14型八種豬胸膜肺炎放線桿菌血清型的復合PCR分型試劑盒，其特征在于，所述陰性對照為副豬嗜血桿菌的DNA。

5.利用權利要求1~4所述復合PCR分型試劑盒檢測區分1型、3型、4型、5型、6型、10型、12型和14型八種豬胸膜肺炎放線桿菌血清型的方法，包括如下步驟：

（1）將樣品預處理制備得到PCR模板；

（2）依次在PCR反應管中加入PCR混合酶、5對特異性引物、PCR模板、ddH₂O，混勻后得到PCR反應體系；隨后進行PCR擴增反應，反應結束后，得到PCR擴增產物；

（3）采用瓊脂糖凝膠對PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，根據電泳結果判斷樣品中豬胸膜肺炎放線桿菌的血清型。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟（1）所述樣品為臨床病變的組織樣品或豬胸膜肺炎放線桿菌菌株。

7.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟（1）所述樣品預處理的工序為：用無菌ddH₂O洗滌，煮沸 5~10 min，冰浴 3 min，12000 r/min 離心1min，上清液即為PCR模板。

8.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟（2）所述PCR反應體系的組成：在PCR反應管中加入PCR混合酶12.5μL，第一對特異性引物、第二對特異性引物和第三對特異性引物各0.75μL，第四對特異性引物和第五對特異性引物各1.0μL，PCR模板1.5μL，最后補充ddH₂O到終體積為25μL。

9.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟（2）所述PCR擴增反應的條件參數為：94℃預變性5min；94℃變性10s，56℃退火，72℃延伸90s，30個循環。