[發明專利]一種高通量篩選分離蘇云金芽胞桿菌的方法和應用

有效

• 申請號: 201810402728.5
• 申請日: 2018-04-28
• 公開（公告）號: CN108611296B
• 公開（公告）日: 2020-08-11
• 發明（設計）人: 王奮山;姚英娟;劉子榮;徐雪亮;劉小娟;曾紹民
• 申請（專利權）人: 江西省農業科學院農業應用微生物研究所(江西省農村能源研究中心)
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N1/02;C12R1/07
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 龔瑩瑩

本發明屬于微生物學領域，公開了一種高通量篩選分離蘇云金芽胞桿菌（簡稱Bt）的方法和應用。本發明提供的方法，通過連續三步不同策略的選擇性培養，使樣品中Bt細胞的絕對生物量和相對比例均大幅度提高，需要挑取轉接培養和鏡檢的菌落數減少，分離效率大大提高，操作更加簡便；同時需要的樣品量減少，可實現高通量操作，特別適用于從樣品量很小的樣品或Bt生物量很小的樣品中分離Bt菌株。

技術領域

本發明涉及微生物學領域，具體涉及一種高通量篩選分離蘇云金芽胞桿菌(簡稱Bt)的方法和應用。

背景技術

蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis,簡稱Bt)是目前應用最成功最廣泛的生防微生物之一，在生物殺蟲劑和轉基因抗蟲育種方面具有重要的研究和應用價值。從自然界中分離Bt菌株是長期性基礎性的工作，是生防資源挖掘最重要的內容。現存分離篩選Bt的方法有以下4種：

1.直接分離法

直接分離法是細菌通用的分離方法，方法是將樣品制備成懸浮液，系列稀釋后涂布到LB平板上培養出肉眼可見的單菌落，挑取芽胞桿菌特征的單菌落，轉接到芽胞化培養基上培養至芽胞期，通過制片和顯微鏡觀察，篩選具有伴胞晶體的菌落即為Bt菌株。該方法所用的LB培養基對Bt菌株沒有選擇性，所以受樣品中其他芽胞桿菌的影響和干擾比較大，需要挑取鑒定的菌落數量很大，轉接培養和制片鏡檢的工作量都很大，分離效率比較低。

2.乙酸鈉分離法

該方法來源于1987年的一篇文獻報道，方法是將樣品在含有0.25M乙酸鈉的LB液體培養基中培養，由于Bt的芽胞對乙酸鈉敏感沒有萌發，而其他芽胞桿菌萌發生長為營養細胞，然后將培養液進行高溫處理，萌發的雜菌被殺滅，處于芽胞狀態的Bt細胞由于耐熱存活下來，最后通過后續的平板培養和制片鏡檢進行分離篩選。該方法的優點是通過芽胞萌發培養和高溫處理濾除了大部分芽胞類細菌的干擾，后續需要挑取鏡檢篩選的菌落數減少，節省了時間和工作量；但該方法的缺點正如該文獻中顯示的，就是有少部分受測試的Bt菌株仍然能在0.25M乙酸鈉LB培養基培養中萌發，導致在后續高溫處理時被濾除，所以該方法容易造成潛在新型菌株的漏篩。

3.加熱分離法

該方法由世界衛生組織在2002年提出，并被全球普遍采用。該方法與直接分離法比較類似，差別是在涂布LB平板之前對樣品進行高溫加熱處理，營養細胞狀態的細菌被滅活，芽胞狀態的細菌得以保留。該方法的優點是排除了非芽胞類細菌的干擾，后續轉接培養和鏡檢篩選的工作量相對比較小；但是該方法的缺陷是加熱處理能夠將樣品中處于非芽胞狀態的Bt細胞殺死，所以該方法不適合于含有營養細胞或萌發芽胞狀態Bt菌株的樣品。

4.芽胞化分離法

該方法是對加熱分離法的改進，就是在加熱之前先對樣品進行芽胞化培養，使其中非芽胞狀態的細菌芽胞化，從而避免在高溫處理時被滅活。該方法的優點是增加了分離到非芽胞狀態的Bt菌株的機會，但是其缺點是芽胞化培養的步驟對Bt菌株沒有選擇性，其他芽胞類細菌也同時芽胞化，不能通過高溫處理濾除，需要挑取大量的菌落進行轉接培養和鏡檢篩選，比較費時費力，分離的效率相對較低。

綜上所述，現存的4種分離方法存在著各種缺陷，主要原因是Bt菌株雖然在自然界分布廣泛，但多數不是優勢種群，在分離過程的共培養中處于競爭劣勢，所以導致現存分離方法的效率比較低，工作量比較大，難于實現高通量操作。

本發明提供的方法，通過連續三步不同策略的選擇性富集培養，提高了Bt細胞在樣品中的絕對生物量和相對比例，分離效率較高，工作量較少，操作簡便，可實現高通量操作。

發明內容

本發明的目的在于提供了一種高通量篩選分離蘇云金芽胞桿菌的方法，方法高效，簡單，準確率高。

本發明的另一個目的在于一種高通量篩選分離蘇云金芽胞桿菌的方法在篩選或分離蘇云金芽胞桿菌中的應用。