[發明專利]一種動物胃腸道線蟲幼蟲孵化與收集方法

在審

• 申請號: 201810401665.1
• 申請日: 2018-04-28
• 公開（公告）號: CN108812551A
• 公開（公告）日: 2018-11-16
• 發明（設計）人: 王敏;韓天龍;張廣和;王麗萍;張艷明;李曉龍;趙婧辛;樊建花;羿靜;王燕春
• 申請（專利權）人: 赤峰市農牧科學研究院
• 主分類號: A01K67/033
• 分類號: A01K67/033
• 代理公司: 赤峰市專利事務所 15103
• 代理人: 周東進

本發明公開了一種動物胃腸道線蟲幼蟲孵化與收集方法，采用如下步驟：糞樣采集、濾除糞渣、一次沉淀、蟲卵漂浮、二次沉淀、三次沉淀、蟲卵孵化、幼蟲收集。本發明提供一種高效的動物胃腸道線蟲幼蟲孵化與收集方法。它避免了霉菌污染整個孵化過程，減少了木炭末和蔗糖等的去除程序和雜質困擾，簡化了操作步驟，糞渣去除率高，縮短了孵化時間，可直接監測孵化過程，避免了檢測回收和樣本浪費，24孔單獨孵化可提供科學試驗方便，適于推廣應用。

技術領域

本發明涉及一種動物胃腸道線蟲幼蟲孵化與收集方法。

背景技術

胃腸道線蟲病是一種常見的人獸共患寄生蟲病。線蟲感染有其特定的生活史，一般為成蟲寄生在感染宿主的胃腸道內，產生大量的卵隨糞便排出體外，卵在適宜條件下發育成感染性蟲卵或幼蟲，經口進入消化道從而感染宿主。在胃腸道線蟲的相關科學研究時，需要孵化并收集大量的各期幼蟲。然而，目前尚沒有高效快捷的動物胃腸道線蟲幼蟲孵化與收集方法，胃腸道線蟲幼蟲的獲得主要是采用平皿孵化法，再應用土壤及植物根結線蟲的收集方法如貝爾曼漏斗法或蔗糖浮選法等。平皿孵化法對動物胃腸道線蟲的孵化效率較低，容易滋生霉菌，糞渣和木炭末很難去除；貝爾曼漏斗法并不能使線蟲與糞便中的其它嗜水蠕蟲進行分離；蔗糖浮選法收集的幼蟲量較低，且很難除糖。針對這些缺點，很難實現大量幼蟲的獲得。因此，急需一種高效的動物胃腸道線蟲幼蟲孵化與收集方法。

發明內容

本發明旨在解決胃腸道線蟲幼蟲孵化與收集方法缺乏問題，克服幼蟲孵化率低、無法去除雜質、混合感染蠕蟲分離、后期除糖、收集困難等，并提供一種高效的動物胃腸道線蟲幼蟲孵化與收集方法。

本發明的技術方案如下：

一種動物胃腸道線蟲幼蟲孵化與收集方法，采用如下步驟：

1、糞樣采集：選取4個月以上未驅蟲的目標動物，通過直腸無菌采集新鮮糞便，裝入無菌樣本袋內；將采集到的糞便于2-8 ℃運輸并保存，72 h內進行糞便蟲卵收集處理；

2、濾除糞渣：稱取20 g糞便樣本放入潔凈三角瓶中，用玻璃棒將糞便搗碎，加入10倍重量的滅菌蒸餾水，放入玻璃珠，反復旋搖三角瓶，使糞便充分破碎并釋放蟲卵；用40目篩濾除糞渣，再用滅菌蒸餾水將蟲卵從糞渣充分洗入濾液中，收集濾液；

3、一次沉淀：將收集的濾液分裝于50 ml離心管中，1500 r/min 離心4 min或靜置20h，使蟲卵沉淀到離心管底部，棄上清；

4、蟲卵漂?。涸诔恋碇屑尤腼柡褪雏}水至50ml刻度，漩渦震蕩15 s，靜置10 min，1000r/min 離心4 min，靜置5 min，立即用1000 μl移液器，與液面呈45°角，槍頭口一半露出于液面上，帶氣吸取液面表層漂浮物；每50 ml吸取5 ml，分別轉移入各個新離心管內；

5、二次沉淀：于各個新離心管中加入40 ml滅菌蒸餾水，1000 r/min 離心4 min，使大部分蟲卵沉淀到離心管底部，用移液器從上至下慢慢地吸取25 ml上層液體棄掉，吸取時使槍頭剛剛浸入液面下即可；

6、三次沉淀：加入25 ml滅菌蒸餾水，1500 r/min 離心4 min，使蟲卵沉淀到離心管底部，棄上清；

7、蟲卵孵化：按照體積比滅菌蒸餾水和Earle’s液1:1的比例配制平衡液，根據實際需要調整蟲卵濃度，于各個新離心管中加入5-10 ml平衡液，混勻并分裝于24孔板內，于28-32℃，相對濕度70-80%下孵化；

8、幼蟲收集：恒溫安靜孵化48 h后，在倒置顯微鏡下觀察蟲卵孵化情況，每隔12 h觀察一次，孵化出的大多數幼蟲沉淀在24孔板底部，根據需要，能直接收集各期幼蟲。

本發明的優點在于：