[發明專利]一種快速提取棉花纖維DNA的方法及其應用

在審

• 申請號: 201810401271.6
• 申請日: 2018-04-28
• 公開（公告）號: CN108546701A
• 公開（公告）日: 2018-09-18
• 發明（設計）人: 馬磊;田新權;徐雙嬌;方丹;時萌
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院棉花研究所
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/6806
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 夏艷

本發明公開了一種快速提取棉花纖維DNA的方法及其應用，本發明選用棉花纖維作為DNA提取材料，經打碎后在裂解液中裂解，經過多次離心、沉淀，提取得到棉花纖維DNA。該方法操作簡單，可快速進行批量DNA提取，耗時少，并以所獲得的纖維DNA作為模板，對特定基因進行了常規PCR擴增，結果表明所提取的纖維DNA可滿足于常規PCR和SSR分子標記PCR擴增。基于上述特性，通過提取成熟棉纖維DNA，可為棉花重要農藝性狀基因的分子標記輔助選擇育種提供可行的方法，同時在棉花品種溯源方面研究也具有較好的應用價值。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種快速提取棉花纖維DNA的方法及其應用。

背景技術

棉花作為重要的經濟作物，棉纖維與人們的生活息息相關。棉紡織品一直以來被列為中國進口商品中的重要項目，目前我國每年進口棉花高達上百萬噸，來自世界40多個國家和地區，總貨值達上百億美元。大量進口的棉花雖然緩解了國內供需矛盾，但對國產棉原有市場份額造成沖擊，同時進口棉花出現了以次充好、弄虛作假等一系列質量不合格等問題，因此迫切需要一種簡便方法來進行棉花品種純度檢測以及產地溯源。目前有多種方法來鑒定棉花品種純度和真實性，如：小區種植鑒定法、卡那霉素法和DNA分子標記法(周大云等)。DNA分子標記法具有檢測速度快、成本低、結果可靠等特點備受人們青睞。

簡單序列重復SSR(Simple Sequence Repeats)又稱微衛星DNA(MicrosatelliteDNA)標記，實驗操作中對DNA的數量和質量要求不高，即使部分樣品有所降解也可進行分析；實驗程序簡單，操作簡便、快速，用時短，不需要使用同位素；擴增產物可靠穩定，重復性好；被認為是目前構建指紋圖譜的首選標記，目前已有多種植物以SSR分子標記方法構建了相應的指紋圖譜，為品種純度和真偽性鑒定提供理論依據，也為分子育種過程中親本的選育提供參考。

常規用于棉花分子標記的組織多為種子、葉、莖等組織，很少采用棉花纖維作為供試材料，由于成熟棉纖維含有超過90％的纖維素，且DNA多發生降解，這些都限制著提取的棉纖維DNA的數量和品質。因此開發一種快速提取棉花纖維DNA的方法，且提取的DNA能滿足于常規PCR和SSR-PCR擴增，對研究棉花重要農藝性狀和棉花品種純度以及產地溯源具有重要意義。

發明內容

本發明目的在于提供一種快速提取棉花纖維DNA的方法及其在常規PCR擴增和SSR-PCR擴增中的應用，旨在開發以棉花纖維為介質來進行品種純度鑒定、產地溯源等方面的應用。

本發明具體通過以下技術方案來實現：

一種快速提取棉花纖維DNA的方法，包括以下步驟：

1)將棉花纖維充分剪碎后用液氮研磨；

2)加入細胞裂解液充分混合，水浴30分鐘；

3)加入等體積抽提液離心后，取上清加入-20℃預冷異丙醇，緩慢顛倒離心管直至有沉淀析出，-20℃靜置20分鐘；

4)離心棄掉上清液；

5)加入70％乙醇水溶液，離心棄掉上清液，重復2～3次；

6)加入無水乙醇離心，棄掉廢液，室溫晾置；

7)加入無菌水，4℃保存。

進一步，步驟(2)中所述的細胞裂解液為：Tris 100mmol/L、EDTA 10mmol/L、CTAB20g/L、PVP-30 20g/L、Tween20 20g/L、NaCl 1mol/L、β-巰基乙醇2％(v/v)，調pH至8.0。

進一步，步驟(2)中水浴溫度保持在65℃。

進一步，步驟(3)所述的抽提液為氯仿和異戊醇按照體積比為24:1配置得到。