[發明專利]一種水母雪蓮高產黃酮細胞系及其制備方法

在審

• 申請號: 201810398409.1
• 申請日: 2018-04-28
• 公開（公告）號: CN108504623A
• 公開（公告）日: 2018-09-07
• 發明（設計）人: 劉漢石;趙德修;劉雅萍
• 申請（專利權）人: 大連普瑞康生物技術有限公司
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04;C12N13/00;C12P1/00;C12R1/91
• 代理公司: 北京智為時代知識產權代理事務所(普通合伙) 11498
• 代理人: 王加嶺;楊靜

本發明提供了一種水母雪蓮高產黃酮細胞系的制備方法及培養基，其制備方法為：采用水母雪蓮種子誘導愈傷組織；將獲得的愈傷組織進行固體繼代培養；用目測法繼代培養的愈傷組織中直接挑選總黃酮的含量高的細胞系；轉到液體培養，再從液體轉入到固體培養，如此不斷地反復篩選、繼代多次后得到成長迅速、總黃酮的含量較高產細胞系。用本發明制備的細胞系和培養基，細胞在光照懸浮培養溫度25℃左右，其細胞生長速率可達45g?50g干重/升/月，黃酮類化合物的含量可達培養物干重的12％。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種水母雪蓮高產黃酮細胞系的制備方法及培養基。

背景技術

水母雪蓮(Sausurea medusa Maxim.)是藏藥“雪蓮”藥材的原植物，分布在我國青海、甘肅、西藏等地，是藏藥中的名貴藥材。雪蓮中含黃酮、生物堿、內酯、甾醇、揮發油、多糖等多種成分，其有效成分主要為黃酮類化合物。黃酮類化合物的藥理作用包括抗癌、抗腫瘤，抗心腦血管疾病，鎮咳祛痰，抗炎、鎮痛作用，免疫調節作用，雌性激素樣作用，抗菌及抗病毒作用，抗氧化、抗衰老作用，抗輻射。以黃酮類化合物為有效成分的雪蓮注射液治療偏頭痛效果顯著。又如用來治療偏癱的雪蓮通脈丸、雪蓮注射液和治療腦動脈硬化與缺血性中風的雪蓮通脈口服液，都是以黃酮類化合物含量為質量標準的。

雪蓮生長在海拔2400米至4000米以下的石縫、礫石坡和濕潤沙地上，屬于生長期較長的耐寒植物，通常需用5年時間才能生長為成熟的植株。由于雪蓮藥用價值高、資源貧乏。導致掠奪式盜挖嚴重，已經威脅到了雪蓮物種的生存，且采集野生雪蓮對野生資源具有嚴重的破壞性。

雪蓮中有效成分結構復雜，難以化學合成。通過植物細胞大量培養生產植物藥可不受自然條件的限制，對藥物質量容易控制。不占用耕地面積，以及對保護國家珍稀植物物種，維護生物多樣性及持續發展具有重要意義。但是，目前采用植物細胞進行培養，其獲得有效成分黃酮類化合物含量低，通常只有干重的6-7％左右，對于能產生較高黃酮類化合物產量細胞系，一直較難培育，如何能獲得一種較高黃酮類化合物含量、發酵期短的細胞系的方法，更是比較困難。

發明內容

為解決現有技術的上述技術問題，本發明提供一種水母雪蓮高產黃酮細胞系的制備方法，該方法所獲得的黃酮高產細胞系，其遺傳性能穩定，黃酮含量高，細胞懸浮培養易形成細胞聚集體，比較適合于大型生物反應器規?；呐可a。

為實現上述目的，本發明采用以下的技術方案為：

一種水母雪蓮高產黃酮細胞系的制備方法，其包括如下步驟：

S1、采用水母雪蓮種子誘導愈傷組織；

S2、將步驟S1獲得的愈傷組織進行固體繼代培養；

S3、用目測法從步驟S2中的愈傷組織中直接挑選總黃酮的含量高的細胞系；

S4、將步驟S3獲得的細胞系從固體培養轉到液體培養，再從液體轉入到固體培養，如此不斷地反復篩選、繼代多次得到成長迅速、總黃酮的含量較高的細胞系。

如上所述的制備方法，優選地，所述方法還包括：

S5、將步驟S4獲得的所述較高產細胞系作60Coγ-射線照射誘變，之后采用小細胞團篩選法，獲得總黃酮高產量的細胞系。

如上所述的制備方法，優選地，所述步驟S1包括將水母雪蓮種子消毒后，去掉外殼和種皮，然后接在含3mg/L的2,4-二氯苯氧基乙酸的培養基中，25℃暗培養，30d后從種子胚軸和子葉邊緣能夠生長出顆粒狀愈傷組織，每2周繼代一次。

如上所述的制備方法，優選地，所述消毒為先用70-75％乙醇消毒1分鐘，無菌水沖洗，再用2％的次氯酸鈉溶液振蕩消毒60-62min，再用無菌水沖洗。