[發(fā)明專利]一種水母雪蓮高產(chǎn)黃酮細胞系及其制備方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201810398409.1 | 申請日： | 2018-04-28 |
| 公開（公告）號： | CN108504623A | 公開（公告）日： | 2018-09-07 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 劉漢石;趙德修;劉雅萍 | 申請（專利權(quán)）人： | 大連普瑞康生物技術(shù)有限公司 |
| 主分類號： | C12N5/04 | 分類號： | C12N5/04;C12N13/00;C12P1/00;C12R1/91 |
| 代理公司： | 北京智為時代知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11498 | 代理人： | 王加嶺;楊靜 |
| 地址： | 116023 遼寧省大連*** | 國省代碼： | 遼寧;21 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 制備 水母雪蓮 繼代培養(yǎng) 愈傷組織 培養(yǎng)基 總黃酮 干重 黃酮 黃酮類化合物 誘導(dǎo)愈傷組織 高產(chǎn) 高產(chǎn)細胞系 固體培養(yǎng) 細胞生長 懸浮培養(yǎng) 液體培養(yǎng) 目測法 培養(yǎng)物 繼代 光照 篩選 轉(zhuǎn)入 細胞 | ||
1.一種水母雪蓮高產(chǎn)黃酮細胞系的制備方法，其特征在于，其包括如下步驟：
S1、采用水母雪蓮種子誘導(dǎo)愈傷組織；
S2、將步驟S1獲得的愈傷組織進行固體繼代培養(yǎng)；
S3、用目測法從步驟S2中的愈傷組織中直接挑選總黃酮的含量高的細胞系；
S4、將步驟S3獲得的細胞系從固體培養(yǎng)轉(zhuǎn)到液體培養(yǎng)，再從液體轉(zhuǎn)入到固體培養(yǎng)，如此不斷地反復(fù)篩選、繼代多次后得到成長迅速、總黃酮的含量較高的細胞系。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述方法還包括：
S5、將步驟S4獲得的所述較高產(chǎn)細胞系作60Coγ-射線照射誘變，之后采用小細胞團篩選法，獲得總黃酮高產(chǎn)量的細胞系。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟S1包括將水母雪蓮種子消毒后，去掉外殼和種皮，然后接在含3mg/L的2,4-二氯苯氧基乙酸的培養(yǎng)基中，25℃暗培養(yǎng)，30d后從種子胚軸和子葉邊緣能夠生長出顆粒狀愈傷組織，每2周繼代一次。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述消毒為先用70-75％乙醇消毒1分鐘，無菌水沖洗，再用2％的次氯酸鈉溶液振蕩消毒60-62min，再用無菌水沖洗。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟S2中愈傷組織的培養(yǎng)采用的培養(yǎng)基中添加有0.2mg/L的芐氨基腺嘌呤，2mg/L萘乙酸進行繼代培養(yǎng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，在所述步驟S2中，采用58.4μmol·m-2·s-1日光燈照射，25℃下培養(yǎng)，每隔2周繼代1次。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，在所述步驟S4中，所述繼代為12-30次。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項所述的制備方法，其特征在于，
采用的培養(yǎng)基的配方為：
大量元素：NH4NO3 1200mg/L，KNO3 1200mg/L，CaCl2·2H2O 300mg/L，MgSO4·7H2O370mg/L，KH2PO4 300mg/L；
微量元素：H3BO3 6.2mg/L，MnSO4·4H2O 22.3mg/L，ZnSO4·7H2O 10mg/L，Na2MnO4·2H2O0.25mg/L，CuSO4·5H2O 0.025mg/L，CoCl2·6H2O 0.025mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 22mg/L,Na2-EDTA·2H2O 30mg/L；
有機成分：肌醇100mg/L，煙酸0.5mg/L，鹽酸吡哆醇0.5mg/L，鹽酸硫胺素0.5mg/L，甘氨酸2mg/L，蔗糖30g/L，瓊脂7g/L，pH為5.8，其中，液體培養(yǎng)時不添加瓊脂，在所述步驟S1中所用的培養(yǎng)基中為所述大量元素減半的培養(yǎng)基。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項制備方法制備的水母雪蓮高產(chǎn)黃酮細胞系在用于制備黃酮類化合物中的應(yīng)用。
10.一種用于水母雪蓮高產(chǎn)黃酮細胞系的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基的配方為：含有1200mg/L的NH4NO3，1200mg/L的KNO3，300mg/L的CaCl2·2H2O，370mg/L的MgSO4·7H2O，300mg/L的KH2PO4；6.2mg/L的H3BO3，22.3mg/L的MnSO4·4H2O，10mg/L的ZnSO4·7H2O，0.25mg/L的0.25mg/L的Na2MnO4·2H2O，0.025mg/L的CuSO4·5H2O，0.025mg/L的CoCl2·6H2O，22mg/L的FeSO4·7H2O，30mg/L的Na2-EDTA·2H2O；100mg/L的肌醇，0.5mg/L的煙酸，0.5mg/L的鹽酸吡哆醇，0.5mg/L的鹽酸硫胺素，2mg/L的甘氨酸，30g/L的蔗糖和7g/L的瓊脂，pH為5.8。
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