[發明專利]一種分析微量根尖上下層細胞轉錄組的方法

有效

• 申請號: 201810398168.0
• 申請日: 2018-04-28
• 公開（公告）號: CN108486239B
• 公開（公告）日: 2021-11-05
• 發明（設計）人: 樓巧君;李鐵梅;陳亮;羅利軍
• 申請（專利權）人: 上海市農業生物基因中心
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12Q1/6806
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識產權代理有限公司 31227
• 代理人: 曹莉

1.一種分析微量根尖細胞轉錄組的方法，其特征在于，所述方法為不采用激光捕獲顯微切割技術的進行微量根尖上下層細胞分離，并進行轉錄組分析的方法；所述方法包括如下步驟：

S1、挑選健康的植物種子胚朝下插入厚度為0.5-1厘米的透明凝膠板內，在28-33℃生長箱內發芽3天；所述透明凝膠板由溶入處理劑的透明凝膠制備而得；所述處理劑為激素、營養成分、重金屬抑制劑中的一種或幾種；所述透明凝膠板的透明凝膠選自瓊脂糖膠、卡拉膠、魔芋膠和明膠；

S2、切取0.5-1厘米根尖所在的透明凝膠塊，保證根尖落在透明凝膠塊中心；

S3、將透明凝膠塊根尖所在的一面朝上，用彩色包埋液包埋透明凝膠塊，迅速冷凝；

S4、將已冷凝的樣品放入冰凍切片機的載物臺上固定，開始修片至看見白色的根尖樣品，開始正式切取樣品；冰凍切片機的溫度設為零下23-零下28攝氏度，切片的厚度設定為10-20微米；

S5、挑取根尖切片放入RNA提取裂解液中，冰上抽真空使所述裂解液充分浸潤根尖切片樣品；

S6、進行總RNA的提取；

S7、進行mRNA反轉錄和線性預擴增，使原始的mRNA以線性的方式進行擴增，濃度上達到二代測序的要求；

S8、進行質量檢測、建庫、上機測序，數據分析；數據分析時，根據基因的覆蓋率，對每個基因采用各自不同覆蓋度進行長度截取獲得基因的表達量值；

對每個基因采用各自不同覆蓋度進行長度截取具體為：基因覆蓋度90％～100％對應的3'端截取基因長度比率為100％，基因覆蓋度80％～90％對應的3'端截取基因長度比率為95％，基因覆蓋度70％～80％對應的3'端截取基因長度比率為85％，基因覆蓋度60％～70％對應的3'端截取基因長度比率為75％，基因覆蓋度50％～60％對應的3'端截取基因長度比率為65％，基因覆蓋度40％～50％對應的3'端截取基因長度比率為55％，基因覆蓋度40％對應的3'端截取基因長度比率為50％。

2.根據權利要求1所述的分析微量根尖細胞轉錄組的方法，其特征在于，步驟S3中，所述彩色包埋液是將化學性質穩定的色粉加入透明的原始包埋液中，混合均勻制備而得；所述色粉和原始包埋液的體積比為2-8％。

3.根據權利要求2所述的分析微量根尖細胞轉錄組的方法，其特征在于，所述色粉為活性炭。

4.根據權利要求1所述的分析微量根尖細胞轉錄組的方法，其特征在于，步驟S3中，冷凝時間為2-5分鐘。

5.根據權利要求1所述的分析微量根尖細胞轉錄組的方法，其特征在于，步驟S5中，冰上抽真空的時間為8-15分鐘。