[發明專利]一種分析微量根尖上下層細胞轉錄組的方法

有效

• 申請號: 201810398168.0
• 申請日: 2018-04-28
• 公開（公告）號: CN108486239B
• 公開（公告）日: 2021-11-05
• 發明（設計）人: 樓巧君;李鐵梅;陳亮;羅利軍
• 申請（專利權）人: 上海市農業生物基因中心
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12Q1/6806
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識產權代理有限公司 31227
• 代理人: 曹莉

本發明公開了一種分析微量根尖細胞轉錄組的方法：健康種子胚朝下插入0.5?1厘米厚透明凝膠板內，生長發芽；切取0.5?1厘米根尖所在透明凝膠塊，保證根尖落在其中心；將透明凝膠塊根尖所在一面朝上，用彩色包埋液包埋，迅速冷凝，冰凍切片；修片至看見白色的根尖樣品，取樣；挑取根尖切片放入RNA提取裂解液；進行總RNA提取；進行mRNA反轉錄和線性預擴增；進行質量檢測、建庫、上機測序；根據基因覆蓋率，對每個基因采用不同覆蓋度進行長度截取，轉錄組數據分析。該方法解決了根尖樣品原始位置標記的問題；解決了簡便分割微量細胞樣品的問題；解決了微量細胞RNA提取和預擴增的問題；解決了微量細胞轉錄組數據精確分析的問題。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種分析微量根尖細胞轉錄組的方法，解決了微量植物細胞進行轉錄組分析的難題。

背景技術

轉錄組廣義上指某一生理條件下，細胞內所有轉錄產物的集合，包括信使RNA、核糖體RNA、轉運RNA及非編碼RNA；狹義上指所有mRNA的集合。根據中心法則，遺傳信息從DNA(基因)轉錄到RNA(轉錄本)再翻譯成蛋白質，因此轉錄組是連接基因組遺傳信息與生物功能蛋白質的必然紐帶。轉錄水平的調控成為生物體最重要的調控方式，也是目前研究最多的調控方式。轉錄組研究是基因功能及結構研究的基礎和出發點，通過新一代高通量測序，能夠全面快速地獲得某一物種特定組織或器官在某一狀態下的幾乎所有轉錄本序列信息，已廣泛應用于基礎研究、臨床診斷和藥物研發等領域。

根是植物吸收營養和水分的重要器官。通過轉錄組的手段進行植物根系研究，有助于解析植物生長發育、營養吸收和水分吸收和運輸等內在的機制，為農業生產和糧食安全提供技術支撐。根尖的生長角度主要是由根尖上下側細胞的不對稱生長引起的，通過分析根尖上下側細胞的轉錄譜，可以幫助解析根的生長角度形成等發育問題，為研究植物根的向性生長提供支持。

由于RNA的穩定性遠低于DNA，RNA更容易降解斷裂，所以轉錄組分析的難度要高于基因組分析。在現今通用的高通量二代測序手段條件下，進行轉錄組分析時，對樣品的純度和濃度有一定的要求，比如總RNA的OD值應在1.8至2.2之間，電泳檢測28S∶18S至少大于1.5；總RNA樣品總量不低于15ug。另外，轉錄組還不同于基因組的是，每個細胞在某個特定條件下的轉錄組情況都是不同的，每個細胞都有自己獨特的轉錄譜。所以非常有必要進行微量并且最好是單細胞的轉錄組分析，以幫助研究者了解目標組織或者特定細胞的在某特定情況下的轉錄調控情況。但是由于植物細胞有細胞壁的存在，限制了RNA的釋放，因此現今的文獻和專利未見對單個普通植物細胞進行轉錄組分析的方法報導。不過，在動物上的有較成熟的單細胞轉錄組分析方法(Picelli S，Faridani O R，Ketal.Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2[J].NatureProtocols，2014，9(1)：171-181.和Picelli S，K，Faridani O R，etal.Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in singlecells.[J].Nature Methods，2013，10(11)：1096.)，在植物的花粉四分體細胞上等特殊的沒有完備細胞壁結構的細胞上也有相關報道(Li，X.，Li，L.and Yan，J.(2015)Dissectingmeiotic recombination based on tetrad analysis by single-microsporesequencing in maize.Nat.Commun.6，6648)。迄今為止，雖然沒有對單個普通植物細胞的表達譜研究，但是在微量均質植物細胞的研究上還是有一些進展。根據文獻報導情況，現在植物特定微量細胞的表達譜研究，都是采用了顯微切割技術(Laser Capture Micro-dissection，LCM)來獲取少量均質的細胞，再通過多次富集或者擴增的方法獲得足夠可用的RNA(Takehisa H，Sato Y，lgarashi M，et al.Genome-wide transcriptome dissectionof the rice root system：implications for developmental and physiologicalfunctions[J].Plant Journal for CellMolecular Biology，2015，69(1)：126-140.)。