[發明專利]一種糞污噬菌體DNA的提取方法、提取糞污噬菌體DNA的試劑盒及該試劑盒的應用

在審

• 申請號: 201810394101.X
• 申請日: 2018-04-27
• 公開（公告）號: CN108410858A
• 公開（公告）日: 2018-08-17
• 發明（設計）人: 張安云;楊艷鮮;王紅寧;雷昌偉;楊鑫
• 申請（專利權）人: 四川大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 成都頂峰專利事務所(普通合伙) 51224
• 代理人: 楊俊華

本發明屬于生物技術領域，公開了一種糞污噬菌體DNA的提取方法，該方法采用超濾濃縮法和硅膠吸附柱法相結合，即首先采用超濾濃縮器濃縮純化噬菌體，然后再采用硅膠吸附柱法提取噬菌體DNA。本發明還公開了利用前述糞污噬菌體DNA的提取方法提取糞污噬菌體DNA的試劑盒及該試劑盒的應用。本發明的優點在于，通過對現有技術的改進，結合100?kDa超濾濃縮器和硅膠吸附柱可以在5h內獲得濃度約為53.47ng/μL的糞污噬菌體DNA，本發明提供的糞污噬菌體DNA的提取方法不僅縮短了提取時間，且提取的DNA濃度和純度較好，滿足后期qPCR和宏基因組測序要求。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種糞污噬菌體DNA的提取方法、提取糞污噬菌體DNA的試劑盒及該試劑盒的應用。

背景技術

腸道微生物群落是耐藥基因的天然儲存庫，動物糞污中含有較豐富的耐藥基因。噬菌體是一類以細菌為宿主的病毒，是耐藥基因水平轉移的重要載體，因此，提取噬菌體DNA是研究糞污DNA中耐藥基因的種類和豐度的關鍵。Nature protocols中詳細介紹了從糞污樣品中提取噬菌體DNA的方法，利用CsCl 密度梯度離心對糞污獲得的噬菌體原液進行純化，再通過甲酰胺/CTAB法提取噬菌體DNA[Thurber,R.V.H.,Matthew Breitbart,MyaWegley,Linda Rohwer, Forest,Laboratory procedures to generate viralmetagenomes.Nature Protocols, 2009.4(4):470-483]。另一種噬菌體DNA提取方法是Quirós[Brown-Jaque,M., Calero-Cáceres,W.,Espinal,P.,Rodríguez-Navarro,J.,Miró,E.,González-López, J.J.,Cornejo,T.,Hurtado,J.C.,and F.Navarro,Muniesa,M.,Antibiotic resistance genes in phage particles isolated from human faeces andinduced from clinical bacterial isolates.International Journal ofAntimicrobial Agents,2018.51(3): 434-442]和Colomer-Lluch等[Colomer-Lluch,M.,Imamovic,L.,Jofre,J.,Muniesa, M.,Bacteriophages carrying antibioticresistance genes in fecal waste from cattle, pigs,and poultry.AntimicrobAgents Chemother,2011.55(10):49008-49011.]利用 100-kDa超濾濃縮器對噬菌體原液進行純化濃縮，然后通過苯酚/氯仿抽提法提取DNA。上述的兩種方法中，CsCl密度梯度離心法對設備要求高，且離心時間長；甲酰胺/CTAB法和苯酚/氯仿抽提法提取DNA也都比較耗時，且甲酰胺、 CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)和苯酚/氯仿都是對人體有害的溶劑。目前，急需開發一種可快速便捷糞污提取噬菌體DNA方法或試劑盒。

發明內容

為了解決現有技術存在的上述問題，本發明目的在于提供一種糞污噬菌體 DNA的提取方法、提取糞污噬菌體DNA的試劑盒及該試劑盒的應用。

本發明所采用的技術方案為：

一種糞污噬菌體DNA的提取方法，該方法采用超濾濃縮法和硅膠吸附柱法相結合，即首先采用超濾濃縮器濃縮純化噬菌體，然后再采用硅膠吸附柱法提取噬菌體DNA。

具體的，上述糞污噬菌體DNA的提取方法，包括以下步驟：

(1)超濾濃縮法濃縮純化噬菌體：對糞污進行預處理，得到濾液，利用 100-kDa超濾濃縮器對濾液進行濃縮，得到濃縮液；

(2)硅膠吸附柱法提取噬菌體DNA，具體包含以下步驟：