[發明專利]一種糞污噬菌體DNA的提取方法、提取糞污噬菌體DNA的試劑盒及該試劑盒的應用

在審

• 申請號: 201810394101.X
• 申請日: 2018-04-27
• 公開（公告）號: CN108410858A
• 公開（公告）日: 2018-08-17
• 發明（設計）人: 張安云;楊艷鮮;王紅寧;雷昌偉;楊鑫
• 申請（專利權）人: 四川大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 成都頂峰專利事務所(普通合伙) 51224
• 代理人: 楊俊華

1.一種糞污噬菌體DNA的提取方法，其特征在于，該方法采用超濾濃縮法和硅膠吸附柱法相結合，即首先采用超濾濃縮器濃縮純化噬菌體，然后再采用硅膠吸附柱法提取噬菌體DNA。

2.根據權利要求1所述的糞污噬菌體DNA的提取方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)超濾濃縮法濃縮純化噬菌體：對糞污進行預處理，得到濾液，利用100-kDa超濾濃縮器對濾液進行濃縮，得到濃縮液；

(2)硅膠吸附柱法提取噬菌體DNA，具體包含以下步驟：

S1:向所述濃縮液中加入DNase I，反應后加入EDTA滅活DNase I，得到中間液一；

S2:向所述中間液一中加入蛋白酶K裂解噬菌體，反應，離心，取上清，得到噬菌體裂解液上清；

S3:向所述噬菌體裂解液上清中加入DNA結合液，混勻，加入乙醇，混勻，得到中間液二，將中間液二移入吸附柱，離心，去濾液，得到吸附柱一；

S4:向吸附柱一中加入去蛋白液，離心，去濾液，得到吸附柱二：

S5:向吸附柱二中加入漂洗液，離心，去濾液，得吸附柱；

S6:重復步驟S5；

S7:向吸附柱中加入TE洗脫液，離心，得到濾液，即所述糞污噬菌體DNA。

3.根據權利要求1或2所述的糞污噬菌體DNA的提取方法，其特征在于：所述結合液包含8mol/L鹽酸胍，20mmol/L Tris-HCl，所述結合液的pH為6.5。

4.根據權利要求3所述的糞污噬菌體DNA的提取方法，其特征在于：所述去蛋白液包含4mol/L鹽酸胍，20mmol/L Tris-HCl和乙醇，所述乙醇在所述去蛋白液中的體積百分數為70％，所述蛋白液的pH為6.5。

5.根據權利要求4所述的糞污噬菌體DNA的提取方法，其特征在于：所述漂洗液包含20mol/L NaCl，2mol/L Tris-HCl和乙醇，所述乙醇在所述漂洗液中的體積百分數為70％，所述漂洗液的pH為8.0。

6.根據權利要求5所述的糞污噬菌體DNA的提取方法，其特征在于：所述步驟S1中反應條件為37℃溫育1h。

7.根據權利要求6所述的糞污噬菌體DNA的提取方法，其特征在于：所述S2中加入的蛋白酶K至蛋白酶K的終濃度為50μg/mL，所述S2中加入蛋白酶K后反應的條件為55℃溫育1h，所述步驟S2中添加蛋白酶K時，還添加SDS至SDS的質量體積百分數為0.5％。

8.根據權利要求7所述的糞污噬菌體DNA的提取方法，其特征在于：所述糞污預處理包括以下步驟：向糞便中加入SM緩沖液，震蕩，過濾，得到糞污預處理液，將糞污預處理液離心取上清，過濾，得到濾液。

9.一種利用權利要求3～8任意一項所述的糞污噬菌體DNA的提取方法提取糞污噬菌體DNA的試劑盒，其特征在于，包括硅膠吸附柱，還包括以下試劑：

(1)蛋白酶K；

(2)結合液，所述結合液包含8mol/L鹽酸胍，20mmol/L Tris-HCl，所述結合液的pH為6.5；

(3)去蛋白液：所述去蛋白液包含4mol/L鹽酸胍，20mmol/L Tris-HCl和乙醇，所述乙醇在所述去蛋白液中的體積百分數為70％，所述蛋白液的pH為6.5；

(4)漂洗液：所述漂洗液包含20mol/L NaCl，2mol/L Tris-HCl和乙醇，所述乙醇在所述漂洗液中的體積百分數為70％，所述漂洗液的pH為8.0；

(5)TE洗脫液。

10.一種權利要求9所述的試劑盒在提取糞污噬菌體DNA中的應用。