[發明專利]構建Doxycycline/Mifepristone誘導過表達的帶有熒光蛋白標記基因的雙誘導表達載體

在審

• 申請號: 201810391909.2
• 申請日: 2018-04-27
• 公開（公告）號: CN108486155A
• 公開（公告）日: 2018-09-04
• 發明（設計）人: 陳波;馬峰;滕嘉雯
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院輸血研究所
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/65
• 代理公司: 成都九鼎天元知識產權代理有限公司 51214
• 代理人: 易小藝

本發明屬于生物技術領域，尤其涉及一種構建Doxycycline/Mifepristone誘導過表達的帶有熒光蛋白標記基因的雙誘導表達載體及構建方法及應用，所述表達載體系統核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發明中表達載體系統可以在幾乎所有生物和細胞中正常表達且無滲漏表達，避免了基因沉默以及轉導病毒可能帶來的細胞毒性和免疫反應，系統特異性高，安全性高，誘導效率高，誘導具有可逆性，可以用多種轉染方法進行轉基因操作。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，尤其涉及一種構建Doxycycline/Mifepristone誘導過表達的帶有熒光蛋白標記基因的雙誘導表達載體及構建方法及應用。

背景技術

目前已知的基因過表達載體有慢病毒載體、類腺病毒載體、轉座子載體、非整合質粒等等，其中整合載體是最適合構建穩定轉基因細胞系或模式動物的基因過表達載體，慢病毒載體和轉座子載體PiggyBac是目前公認最有效的整合載體。

慢病毒載體在高滴度條件下幾乎可以轉染全部目標細胞，侵染及整合效率高。但它也有一些缺點：存在物種特異性，一般而言只能轉染人類細胞，應用面有限；載體本身體積大而有效容量小，分子遺傳學操作困難；部分基因序列包裝困難；慢病毒載體整合到基因組后可能只在少數細胞群中有表達，很容易被沉默，基因表達水平不高。

慢病毒載體中的pTRIPZ載體系統(Invitrogen公司)，其Tet-on過表達系統表現優異：目標基因的啟動子是CMV，反式激活因子的啟動子是pUbC，二者沒有物種及細胞型的表達特異性，應用面廣。

發明內容

為了解決以上技術問題，本發明提供一種構建Doxycycline/Mifepristone誘導過表達的帶有熒光蛋白標記基因的雙誘導表達載體及構建方法及應用，表達載體系統可以在幾乎所有生物和細胞中正常表達且無滲漏表達，避免了基因沉默以及轉導病毒可能帶來的細胞毒性和免疫反應，系統特異性高，安全性高，誘導效率高，誘導具有可逆性，可以用多種轉染方法進行轉基因操作。

解決以上技術問題的本發明中的一種構建Doxycycline/Mifepristone誘導過表達的帶有熒光蛋白標記基因的雙誘導表達載體，其特征在于：所述表達載體系統核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本發明中一種構建Doxycycline/Mifepristone誘導過表達的帶有熒光蛋白標記基因的雙誘導表達載體的構建方法，其特征在于：包括以下步驟：

(1)以pSwitch為模板構建反式元件載體PB-Gal4-Teton-trans-vector；

(2)以GeneV5-His B為模板構建順式表達載體PB-Gal4-Teton-cis-vector；

(3)將以上步驟(1)和步驟(2)元件和其它輔助載體(PB200PA-1)載體組合在一起構建成一套雙誘導過表達載體系統。

本發明中根據已有的基于PiggyBac的PB-tet-on-OE(Tet-on系統)和pSwitch和GeneV5-His B載體系統(Gal4/RU486系統)(均是Invitrogen載體或其衍生載體)，通過分子克隆構建嶄新的雙誘導過表達系統。由于元件過大過多，將分別構建反式元件載體和順式元件載體，分別包含Tet-on系統和Gal4/RU486系統的全部反式元件和順式元件。

本發明中構建Doxycycline/Mifepristone誘導過表達的帶有熒光蛋白標記基因的雙誘導表達載體的方法，具體包括如下步驟：

步驟一：反式元件載體PB-Gal4-Teton-trans-vector的構建：