[發明專利]構建Doxycycline/Mifepristone誘導過表達的帶有熒光蛋白標記基因的雙誘導表達載體

在審

• 申請號: 201810391909.2
• 申請日: 2018-04-27
• 公開（公告）號: CN108486155A
• 公開（公告）日: 2018-09-04
• 發明（設計）人: 陳波;馬峰;滕嘉雯
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院輸血研究所
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/65
• 代理公司: 成都九鼎天元知識產權代理有限公司 51214
• 代理人: 易小藝

1. 一種構建Doxycycline/Mifepristone誘導過表達的帶有熒光蛋白標記基因的雙誘導表達載體，其特征在于：所述表達載體系統核苷酸序列如SEQ ID NO.1, NO.2所示。

2.根據權利要求1所述的一種構建Doxycycline/Mifepristone誘導過表達的帶有熒光蛋白標記基因的雙誘導表達載體的構建方法，其特征在于：包括以下步驟：

（1）以pSwitch為模板構建載體PB-Gal4-Teton-trans-vector的反式載體；

（2）以GeneV5-His B為模板構建順式表達載體PB-Gal4-Teton-cis-vector；

（3）將以上步驟（1）和步驟（2）載體和其它輔助載體（PB200PA-1）載體組合在一起構建成一套雙誘導過表達載體系統。

3.根據權利要求2所述的一種構建Doxycycline/Mifepristone誘導過表達的帶有熒光蛋白標記基因的雙誘導表達載體的構建方法，其特征在于：具體包括以上步驟：

步驟一、反式元件載體PB-Gal4-Teton-trans-vector的構建：

以pSwitch為模板，設計引物Switch-5’和Switch-3’擴增pSwitch的反式元件表達框Gal4+TK mini pro +DBD/p65/AD fusion protein +BGH polyA，磷酸化后正向插入PB-teton-OE的衍生載體PB-teton-Mir的SfiI和EcoRI位點之間，從而構建含有Tet-on系統和Gal4/RU486系統反式元件表達框PB-Gal4-Teton-trans-vector；

步驟二、順式表達載體PB-Gal4-Teton-cis-vector-basic的構建：

以GeneV5-His B為模板，設計引物Switch-5’-MluI和BGH PA-3’擴增的順式元件表達框Gal4-MCS-BGH polyA, 引物SV40 Pro-5’和SV40 PA-3’擴增G418抗性基因表達框 SV40early pro +Zeocin resist gene +SV40 polyA +terminator，兩個DNA片段進行融合PCR擴增，其產物的5’被MluI酶切，3’被磷酸化后插入PB-teton-OE的MluI和HpaI之間，從而構建含有Tet-on系統和Gal4/RU486系統順式元件表達框的PB-Gal4-Teton-cis-vector-basic；

步驟三、順式表達載體PB-Gal4-Teton-cis-vector的構建：

以含有mCherry CDS +P2A的質粒為模板設計引物mCherry-HindIII-5’和mCherry -3’擴增其CDS，5’被MluI酶切，3’被磷酸化后后插入PB-Gal4-Teton-cis-vector-basic的HindIII和PmeI之間，構建成PB-Gal4-Teton-cis-vector；

步驟四、將以上其它步驟中載體與其它載體組裝在一起構建表達載體系統。

4.根據權利要求1所述的構建Doxycycline/Mifepristone誘導過表達的帶有熒光蛋白標記基因的雙誘導表達載體在293T細胞系上的應用。

5.根據權利要求4所述的構建Doxycycline/Mifepristone誘導過表達的帶有熒光蛋白標記基因的雙誘導表達載體的應用，其特征在于：所述293T細胞系受鹽酸強力霉素和米非司酮的雙重誘導。

6.根據權利要求4所述的雙誘導帶熒光蛋白標記表達載體的應用，其特征在于：所述鹽酸強力霉素 1 μg/ml，米非司酮 10nM。