[發(fā)明專(zhuān)利]一種基于PRET的磷光探針定量檢測(cè)凝血酶的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810388864.3
• 申請(qǐng)日: 2018-04-27
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108760695B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-08-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張菲;熊艷;邱蕊;李妍
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 天津師范大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): G01N21/64
• 分類(lèi)號(hào): G01N21/64;G01N33/573;G01N33/86
• 代理公司: 天津市杰盈專(zhuān)利代理有限公司 12207
• 代理人: 朱紅星

本發(fā)明公開(kāi)了一種基于PRET的磷光探針特異性引物定量檢測(cè)凝血酶的方法。為了提高其靈敏度，本發(fā)明在TBA上進(jìn)行修飾，得到TBA?BHQ₂探針。利用水熱合成法合成的磷光QDs作為能量供體，TBA?BHQ₂作為能量受體，構(gòu)成磷光共振轉(zhuǎn)移檢測(cè)機(jī)制，導(dǎo)致磷光猝滅。由于凝血酶適配體與凝血酶之間有較強(qiáng)的結(jié)合，從而使MPA包覆的Mn摻雜ZnS磷光量子點(diǎn)與TBA?BHQ₂混合猝滅體系中的TBA?BHQ₂離開(kāi)量子點(diǎn)表面與凝血酶形成新的復(fù)合物，從而使體系磷光強(qiáng)度恢復(fù)。相對(duì)于熒光量子點(diǎn)，磷光量子點(diǎn)因其磷光壽命長(zhǎng)、可避免自體熒光和散色光的干擾、選擇性強(qiáng)、檢測(cè)時(shí)無(wú)需加入任何除氧劑和誘導(dǎo)劑等優(yōu)點(diǎn)，在檢測(cè)中運(yùn)用更加廣泛和靈敏。

本專(zhuān)利受到國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目21375095，天津市自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（No.17JCQNJC05800），天津師范大學(xué)博士基金項(xiàng)目（No.52XB1510）和天津師范大學(xué)“無(wú)機(jī)-有機(jī)雜化功能材料化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室”、“天津市功能分子結(jié)構(gòu)與性能重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室”開(kāi)放基金項(xiàng)目的資助。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物分析檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，主要涉及一種基于PRET的磷光探針對(duì)凝血酶定量檢測(cè)。

背景技術(shù)

適配體是一種短的寡核苷酸，它可以折疊成一個(gè)獨(dú)特的三維結(jié)構(gòu)，它能將小的有機(jī)分子、蛋白質(zhì)或細(xì)胞作為特定靶點(diǎn)。適配體是由上世紀(jì)90年代首次建立由指數(shù)富集(SELEX)系統(tǒng)演化而來(lái)的。從那以后，適配體已經(jīng)成為一個(gè)值得注意的目標(biāo)配體和治療方法。一般來(lái)說(shuō)，適配體的作用與抗體相似，但它在治療應(yīng)用方面有優(yōu)勢(shì)，特別是在腫瘤學(xué)領(lǐng)域。對(duì)于實(shí)體腫瘤的治療，抗體的分子質(zhì)量會(huì)阻礙其進(jìn)入腫瘤的深層部位。相比之下，比抗體(150 kDa)分子量小得多的適配體，其分子量通常在6~30 kDa之間，能更好的進(jìn)入腫瘤深層部位。重要的是，作為一種高度特異性的配體，適配體由于其體積小、化學(xué)和熱穩(wěn)定性好，易于修改和固定，是一種很有吸引力的診斷方法。

在基于適配體的分析方法中，最常見(jiàn)的分子靶點(diǎn)之一是凝血酶（TB）。凝血酶是凝血?jiǎng)┘?jí)聯(lián)的最后一種酶，它將纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為不溶纖維蛋白，形成纖維蛋白凝膠。凝血酶在血液中的濃度變化很大，在健康人的血液中幾乎不存在。然而，在凝血過(guò)程中，它可以達(dá)到低微的濃度，甚至在早期的止血過(guò)程中也能產(chǎn)生低濃度的凝血酶。凝血酶在多種生命過(guò)程中扮演著重要的角色，涉及許多疾病，如血栓栓塞性疾病、炎癥反應(yīng)、心血管疾病和抗凝血療法。因此，對(duì)凝血酶的敏感性檢測(cè)在臨床研究和診斷中具有重要意義。

近年來(lái)，室溫磷光（RTP）量子點(diǎn)（QDs）檢測(cè)受到了廣泛的關(guān)注，已被廣泛應(yīng)用于傳感器，特別是生物分子傳感器。由于能量轉(zhuǎn)移過(guò)程為從三重態(tài)（⁴T₁）到基態(tài)（⁶A₁），因此，Mn摻雜的ZnS QDs在590 nm處表現(xiàn)出較強(qiáng)的磷光發(fā)射。本發(fā)明中，用于檢測(cè)凝血酶的“off-on”磷光傳感系統(tǒng)依賴(lài)于含磷光QDs和帶有BHQ₂染料的特異性凝血酶適配體（BHQ₂-TBA）。QDs作為能量供體，BHQ₂-TBA作為能量受體，構(gòu)成磷光共振轉(zhuǎn)移（PRET）檢測(cè)機(jī)制。

本發(fā)明所用磷光材料與專(zhuān)利ZL201510230335.7（磷光量子點(diǎn)在生物體液和酒中選擇性檢測(cè)谷胱甘肽的應(yīng)用）、ZL201410140175.2（一種磷光量子點(diǎn)Mn-ZnS的制備方法及鐵形態(tài)分析中的應(yīng)用）中所用一致，但是用于檢測(cè)的體系的物質(zhì)不一樣。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服傳統(tǒng)熒光量子點(diǎn)的不足，提供基于磷光量子點(diǎn)為探針檢測(cè)凝血酶的方法。凝血酶適配體（TBA）與凝血酶之間具有較強(qiáng)的特異性結(jié)合，