[發明專利]破傷風免疫球蛋白血樣篩選試劑盒、制備方法及使用方法

在審

• 申請號: 201810388035.5
• 申請日: 2018-04-26
• 公開（公告）號: CN108918880A
• 公開（公告）日: 2018-11-30
• 發明（設計）人: 黃晶;王諾;彭芳霽;曾強;吳邊;羅玉東
• 申請（專利權）人: 武漢生命科技股份有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/543
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 徐楊松

1.一種破傷風免疫球蛋白血樣篩選試劑盒，其特征在于，試劑盒包括破傷風類毒素滅活精純抗原包被的酶標板、抗破傷風桿菌抗體、酶標記物和標準品溶液；所述酶標板上包被的破傷風類毒素滅活精純抗原的蛋白質濃度為0.5-3.0ug/ml；所述酶標記物包括穩定劑A、生物防腐劑和辣根過氧化物酶標記的鼠抗人IgG單克隆抗體，所述鼠抗人IgG單克隆抗體的蛋白濃度大于等于5mg/ml。

2.根據權利要求1所述的一種破傷風免疫球蛋白血樣篩選試劑盒，其特征在于，所述辣根過氧化物酶的酶純度大于等于3.0。

3.根據權利要求1或2所述的一種破傷風免疫球蛋白血樣篩選試劑盒，其特征在于，所述標準品溶液的濃度分別為0.1IU/ml、1.0IU/ml、2.0IU/ml、4.0IU/ml、8.0IU/ml、12.0IU/ml。

4.根據權利要求1-3任一項所述的一種破傷風免疫球蛋白血樣篩選試劑盒，其特征在于，試劑盒還包括濃縮洗滌液、樣品稀釋液、底物液A、底物液B和終止液。

5.根據權利要求4所述的一種破傷風免疫球蛋白血樣篩選試劑盒，其特征在于，所述濃縮洗滌液為含有NaCl、吐溫-20的pH7.2的濃縮磷酸緩沖液；所述底物液A內含有過氧化脲；所述底物液B內含有3,3',5,5'-四甲基聯苯胺；所述終止液為0.5M的H₂SO₄溶液；所述樣品稀釋液內含有檸檬酸鈉緩沖液和穩定劑B。

6.一種如權利要求5所述的破傷風免疫球蛋白血樣篩選試劑盒的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟S100a、制備破傷風類毒素滅活精純抗原包被的酶標板：所述步驟S100a包括S110a至S130a：

步驟S110a、包被液配制：根據抗原包被濃度調試結果配制破傷風類毒素滅活精純抗原包被液；

步驟S120a、封閉液配制：配制抗原封閉液；

步驟S130a、包被酶標板：

所述步驟S130a包括S131a至S134a：

步驟S131a、抗原包被：將配制的破傷風類毒素滅活精純抗原包被液加入到酶標板上的孔中，每孔加入的量為100μl，并將酶標板置于2～8℃環境下包被18～24h；

步驟S132a、封閉：將配制的抗原封閉液加入到酶標板上的孔中，每孔加入的量為150μl，置于2～8℃環境下18～24h；

步驟S133a、干燥：酶標板置于30℃以下、濕度小于35％的環境中干燥2～4h；

步驟S134a、密封：用鋁箔袋真空塑封，即得破傷風類毒素滅活精純抗原包被的酶標板；

步驟S200a、酶標記物的制備：

將辣根過氧化物酶與鼠抗人IgG單克隆抗體采用過碘酸鈉氧化法進行偶聯，得到辣根過氧化物酶標記的鼠抗人IgG單克隆抗體，再將辣根過氧化物酶標記的鼠抗人IgG單克隆抗體與穩定劑A和生物防腐劑混合，得到酶標記物；

步驟S300a、進行濃縮洗滌液、樣品稀釋液、底物液A、底物液B、終止液、標準品溶液的分裝。

7.根據權利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述破傷風類毒素滅活精純抗原包被液的濃度由破傷風類毒素滅活精純抗原與酶標記物采用配合滴定法確定。

8.根據權利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述步驟S100a需在十萬級潔凈區進行。

9.根據權利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述步驟S200a和所述步驟S300a需在萬級潔凈區進行。

10.一種如權利要求5所述的破傷風免疫球蛋白血樣篩選試劑盒的使用方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟S100b、用樣品稀釋液按1：200稀釋血清/血漿樣品或按1：100稀釋全血樣品，取100μL到破傷風類毒素滅活精純抗原包被的酶標板的酶標孔中，37℃孵育30min；

步驟S200b、洗板5次，拍干；

步驟S300b、加酶標記物，37℃孵育30min；

步驟S400b、洗板5次，拍干；

步驟S500b、加入底物液A和底物液B，底物液A和底物液B中的顯色劑被酶標記物上的辣根過氧化物酶催化顯色，顏色的深淺和抗破傷風桿菌抗體的量成正比，若待測血清中不含抗破傷風桿菌抗體，則不顯色；

步驟S600b、以標準品的含量為自變量(X)，以其對應的吸光度值為因變量(Y)，以四參數Logistic曲線擬合回歸方程，將待測樣品的吸光度值代入回歸方程，計算出相應的含量，測定結果＞12.0IU/ml的樣本須稀釋后重新檢測，線性回歸系數r²＜0.99時，視為無效。