[發明專利]二維培養系統在小鼠腸上皮干細胞體外培養中的應用

有效

• 申請號: 201810387390.0
• 申請日: 2018-04-26
• 公開（公告）號: CN108588010B
• 公開（公告）日: 2022-03-08
• 發明（設計）人: 陳曄光;劉媛;亓振
• 申請（專利權）人: 清華大學
• 主分類號: C12N5/074
• 分類號: C12N5/074;C12Q1/02
• 代理公司: 北京清亦華知識產權代理事務所(普通合伙) 11201
• 代理人: 趙天月

本發明提出了一種培養系統。該培養系統用于單層細胞培養，該培養系統包括：基質膠、N2、B27、雙抗、GlutaMAX、N?acetylcysteine、R?spondin 1以及基礎培養基，其中，所述基質膠的厚度為5μm～50μm。該培養系統適用于胃腸道的表皮細胞和干細胞的單層細胞的培養，尤其適用于腸道表皮細胞和腸道干細胞的單層細胞的培養。該培養系統可以更加直觀的觀察胃腸道表皮細胞和干細胞的一系列生化細胞水平的變化，能很好的模擬體內腸道表皮細胞的各項指標，能更加便捷地探索外泌體、炎癥因子等對小腸干細胞穩態的影響，提供低成本、高效率的篩藥體系。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體地，本發明涉及二維培養系統在小鼠腸上皮干細胞體外培養中的應用。

背景技術

腸上皮是人體執行消化吸收功能的主要結構，它更新十分迅速，而它的更新主要是由位于其底部陷窩結構中的腸上皮干細胞所驅動的，因而腸干細胞的研究與人體健康息息相關。近年來，腸上皮干細胞體外培養系統便于在體外直接對腸上皮干細胞進行操作和觀察，大大推動了腸上皮干細胞的研究。這些體外培養的腸上皮干細胞還可以整合進入損傷后的腸上皮，幫助修復腸上皮的損傷，有希望被應用于腸道損傷疾病的治療。

目前，對于小腸上皮細胞和干細胞的研究多依賴于基質膠(Matrigel)的體外三維培養系統。三維培養系統可形成絨毛-陷窩結構的小腸類器官，其可擺脫間充質細胞的依賴并具有自我更新和分化的能力。在進行小鼠小腸上皮類器官培養時，使用的培養條件為：基礎培養基Advanced DMEM/F12、血清替代物N2和B27、雙抗、2mM的GlutaMAX和1mM的N-acetylcysteine，以及所需要的生長因子：50ng/mL的EGF、100ng/mL的Noggin和1ug/mL的R-spondin 1。在進行單細胞培養時，需要在類器官培養基的基礎上加入10μM的Blebbistatin和100ng/mL的Wnt-3a。進行小鼠結腸類器官體外培養時，需要在小腸培養基的基礎上加入100ng/mL的WNt-3a。進行人的小腸培養時需要在小鼠小腸陷窩培養基的基礎上加入100ng/mL的WNt-3a，500nM的A83-01，10μM的SB202190，1M的Nicotinamide和100μM的[Leu15]-Gastrin I。

發明內容

現有技術中的胃腸干細胞、表皮細胞體外培養系統需要基質膠以及加入EGF、Noggin和R-spondin(ENR)或者ENR和Wnt-3a(ENRW)等生長因子的培養基，而基質膠和這些所必須的生長因子價格昂貴，不利于胃腸干細胞和表皮細胞培養系統的推廣，進而限制了胃腸干細胞和表皮細胞在體外大量擴增，用于胃腸道疾病的治療。其次，現有技術中的培養系統的類器官是三維立體存活的，不利于生化細胞水平的直觀觀察。為了解決上述問題，發明人開發了一種體外二維(2D)培養系統，該培養系統利用較少的Matrigel，建立了可以不含EGF和Noggin等生長因子的單層細胞培養系統，同時上述培養系統適用于胃腸道的表皮細胞和干細胞的單層細胞的培養，尤其適用于腸道表皮細胞和干細胞的單層細胞的培養。培養的腸上皮干細胞具有與體內干細胞相似的增殖、分化和凋亡能力，其基因表達水平與三維培養的干細胞具有高度一致性，并且可以有效地在體外維持Lgr5-GFP⁺腸上皮干細胞內在的自我更新和分化能力。并且通過上述培養系統可以更加直觀地觀察胃腸道表皮細胞和干細胞的一系列生化細胞水平的變化，很好的模擬體內腸道表皮細胞和干細胞的各項指標，更加便捷地探索外泌體、炎癥因子等對小腸干細胞穩態的影響，提供低成本、高效率的篩藥體系。